弥漫大B细胞淋巴瘤BCL-2、BCL-6基因重排特点及预后分析

张 淼，毕晓芳，蔡海燕，贺海燕，李 晶，王 平，牛牧文

非霍奇金淋巴瘤(HHL)是一类高度恶性的淋巴造血系统疾病，死亡率居恶性肿瘤第10位。而弥漫大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最常见的一种类型，占西方成人的30%～40%。研究表明，DLBCL的分子遗传学和免疫表型存在差异，导致治疗效果和预后显著不同[1]。BCL-2、BCL-6、C-myc基因是DLBCL中最常发生异常的基因[2]。BCL-2、BCL-6基因重排在宁夏地区DLBCL中有何特点，与临床预后是否存在相关性有待研究。虽然近年来DLBCL的诊治水平不断提高，但生存率仍不理想，30%～50%的患者耐药或复发最终死亡[3]。因此，判断宁夏地区DLBCL的预后影响因素，并有针对性地个体化治疗是我们研究的目的。

1 资料与方法

1.1 一般资料：收集宁夏人民医院病理科2010年1月-2015年10月初次收治的DLBCL患者，选择符合条件的59例(按照WHO2008版组织学分型)。所有DLBCL患者术前均未接受过治疗，且临床实验室资料完整。对所有患者进行电话随访，每3个月随访1次，按照总生存期(OS)计算，即以月为单位，从初次诊断到任何原因导致的失访、死亡，随访日期终止。

1.2 治疗方法:收集患者性别、年龄、名族、临床分期(AnnArbor分期，胃肠道为Lugano分期)、有无B症状、血清乳酸脱氢酶(LDH)有无升高、结外病种累及数量、国际预后指数评分(IPI)和行为状态评分(ECOG)。按照DLBCL诊疗规范选择以蒽环类为基础的联合化疗，一线方案选择CHOP或CHOP样方案，二线选择ICE方案。中位疗程4个周期，部分患者联合放射治疗，有条件者给予利妥昔单抗注射治疗。

1.3 免疫组化染色(ICH):所有标本均使用Dako全自动免疫组化染色机，SP试剂盒均购自北京中杉金桥生物公司，严格按标准程序操作，用试剂盒提供的阳性切片进行对照，用PBS做阴性对照，DAB显色。按照Hans分型标准，根据CD10、BCL-6、MUM-1的表达情况将所有病例分为GCB组和non-GCB组。BCL-2、BCL-6蛋白表达情况见图1-图4(目录后)。

1.4 荧光原位杂交(FISH)检测:所用探针均购置于北京金菩嘉医疗科技公司。BCL-6双色断裂分离探针(重排时显示1个红色与绿色的融合信号，另见1个红色和绿色的分离信号)和BCL-2/IGH双色融合易位探针(易位时显示1个红色信号，1个绿色信号及2个融合信号)，当细胞核内出现3个以上红色信号时判读为染色体区段的扩增[5]。所用病例均行BCL-2和BCL-6基因检测，同时选取淋巴组织反应性增生患者20例作为对照，操作方法参见说明。

1.5 统计学方法:采用SPSS18.0统计软件，对于分类变量资料的描述采用例数与百分比的形式表示，各因素对预后生存时间的影响采用Kaplan-meier检验进行分析，采用Cox模型(最大似然比法)对随访结果预期进行多因素影响因素分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特点：59例DLBCL患者，结内34例(57.6%)，结外25例(42.3%)。结外DLBCL发生部位以胃肠多见为12例(20.3%)，其他部位包括眼部3例(5.0%)，鼻咽、纵膈各2例(各3.4%)，扁桃体、甲状腺、腹膜后、脾脏、子宫、椎体各1例(各1.7%)。59例DLBCL患者中男性34例，女性25例；中位年龄54岁(26～81岁)，≥60岁26例。发生BCL-2基因易位2例，BCL-6基因断裂15例；出现B症状31例，血清LDH升高29例。临床分期Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期29例；IPI评分≥3分25例；ECOG评分>2分25例；结外受累病灶>1个病灶25例；发生骨髓浸润1例。59例患者均接受以蒽环类为基础的联合化疗，39例接受手术治疗，7例化疗加局部放疗，4例给予利妥昔单抗治疗。本组中位随访时间 22.7个月，中位总生存期33.36个月；随访期间死亡30 例，总死亡率50.8%，3年死亡率56.91%，5年生存率69.78%。

2.2 分类及基因重排情况：按照Hans分型标准将患者分为GCB和non-GCB 2组，其中GCB组20例(33.9%)，non-GCB组39例(66.1%)。2组生存曲线见图3(目录后)，经统计学分析(χ2=14.318,RR=5.357，P<0.05)，GCB组预后好于non-GCB组。本组患者发生BCL-2基因易位2例(3.4%)，(χ2=16.554,P<0.05，RR=由于重排失访0，故算不出，值趋向无穷大)发生BCL-2基因融合的预后较差。BCL-6基因断裂15例(25.4%)(χ2=3.225,RR=0.276，P<0.05)，发生BCL-6基因重排的与没有发生重排的预后差异无统计学意义。

2.3 临床预后因素分析:将所有临床相关的单因素参数进入Cox模型中进行预后多因素分析，变量的选择采用LR向后法。相对危险度分别为：Hans分型RR(non-GCB/GCB)=0.067(95%CI0.692～3.773)，RR(BCL-2基因重排/未重排)=0.015(95%CI0.156～1.818)，RR(Ⅲ～Ⅳ期/Ⅰ～Ⅱ期)=0.006(95%CI0.027～0.552)，RR(LDH升高/正常)=0.056(95%CI0.106～1.031)，RR(≥60岁/<60岁)=0.031(95%CI1.004～1.089)，RR(IPI≥3分/<3分)=0.011(95%CI1.012～1.096)。本组数据提示，Hans分型non-GCB组、BCL-2基因发生融合、年龄>60岁，临床分期较晚(Ⅲ-Ⅳ期)、血清LDH升高、IPI评分>3分，均为影响预后的高危险因素。

3 讨论

应用荧光原位杂交(FISH)技术对形态学诊断为DLBCL的59例淋巴瘤标本进行了遗传学异常的检测，与免疫组化染色法结果比对，20例淋巴组织反应性增生患者均未发生基因重排，提示FISH技术在病变性质的判断上较免疫组化染色法更有意义。FISH检测不仅能够确定淋巴组织病变性质，还为淋巴瘤进一步分型提供了重要的诊断性依据。FISH技术可以避免由于免疫组化染色缺陷及医师判读差异等造成的错误诊断，有助于提高淋巴瘤诊断分型的准确性。

由于DLBCL的分子遗传学的差异，导致疗效和预后显著不同。虽然近年来的诊治水平不断提高，但生存率仍不理想。因此，个体化精准诊断和治疗，有助于提高患者的生存质量。在DLBCL中最常发生异常的基因为BCL-2、BCL-6、C-myc基因。本组研究只针对BCL-2、BCL-6基因重排情况进行了研究。在宁夏地区DLBCL中发生BCL-2基因融合的患者预后较差，基因融合与患者临床特征如年龄、临床分期、LDH水平、IPI评分等差异有统计学(P<0.05)。但因为选取病例数及发生基因融合的病例数有限，BCL-2基因融合是否可以作为宁夏地区DLBCL中的一个独立预后因素还有待研究。本组患者的BCL-6基因重排发生于患者的临床特征各项指标差异无统计学意义(P>0.05),提示BCL-6基因重排在宁夏地区DLBCL中不能作为一个独立的预后因素，与国外文献报道一致[6]。

依据生物标记物进行免疫分型，目前应用较为普遍，尤其是Hans分型，但对DLBCL预后的影响尚存在争议，不同研究小组在免疫分型和预后相关性报道也存在分歧[7]。本组患者GCB组和non-GCB组的临床指标差异有统计学意义，GCB组预后显著优于non-GCB组，因此Hans分型可以作为宁夏地区DLBCL的一项预后指标。

由于DLBCL具有分子遗传学上的异质性，按照标准方案治疗，仍有30%～50%的患者最终死亡[3]。风险指数，能够更好地管理患者和指导风险调整后的治疗策略[8]；IPI评分为DLBCL患者的管理提供预后指导，易于实施，是目前流行的临床预后评估工具。本组患者中IPI评分高，是显著的预后不良因素，尤其是IPI评分中以60岁为界限的年龄评估，在本组试验中的得到充分证实。一些研究对年龄和预后的关系也提出了不同看法[9-10]，提示初诊年龄超过50岁已经提示预后不良，因为年轻患者有更强烈接受治疗的愿望[11]。同时，本组患者通过多因素统计分析提示，患者初诊时的临床分期晚、血清LDH显著升高均可作为判断预后不良的有价值的指标，与国内报道一致[11]。本组性别被排除在高危险因素外，但有报道显示男性预后较女性差[11]。出现B症状、ECGO评分>2分也被排除，与文献报道不一致[12]，考虑为B症状的判断和ECGO评分主观因素较大。本组患者死亡30例，总死亡率50.8%，较国内报道死亡率略高[13],可能因为宁夏地区经济落后，延误最佳诊疗时间，而且治疗也相对滞后造成的。本组中只有4例患者使用了利妥昔单抗治疗，因为例数较少，未纳入Cox模型进行临床预后分析，但有研究显示利妥昔单抗治疗患者预后较好。

总之，随着对DLBCL研究的深入，更多的分子遗传学信息将被引入评估中。本组患者通过构建Cox模型多因素分析，提示Hans分型、BCL-2基因融合、年龄、临床分期、LDH水平IPI评分，均为宁夏地区DLBCL的预后不良因子。将在后续的工作中进一步深入研究，同时把相关有意义的数据及时提供给临床，为提高患者的生存率不断努力。

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