艰难梭菌感染实验室检测方法进展

刘 昊(LIU Hao)，徐修礼(XU Xiu-li)，张瑞雪(ZHANG Rui-xue)

(第四军医大学西京医院全军临床检验医学研究所，陕西 西安 710032)

·综述·

艰难梭菌感染实验室检测方法进展

刘 昊(LIU Hao)，徐修礼(XU Xiu-li)，张瑞雪(ZHANG Rui-xue)

(第四军医大学西京医院全军临床检验医学研究所，陕西 西安 710032)

艰难梭菌； 艰难梭菌感染； 培养； 基因检测； 分子生物学方法

艰难梭菌(Clostridiumdifficile,CD)是一种专性厌氧的革兰阳性芽孢杆菌，1935年首次在新生儿肠道正常菌群中被分离出来。1978年起人们发现该细菌是引起抗生素相关性腹泻、医院性腹泻及假膜性肠炎的主要病原体。有资料显示，25%～30%的抗生素相关性腹泻以及90%以上的假膜性肠炎均是由CD引起的，美国由艰难梭菌感染(Clostridium-difficileinfection,CDI)所致的病死率可达7.1%[1]。但是，不是所有的CD均会产生典型的临床症状，CD致病主要是因为产生A、B两种毒素。有研究认为，毒素B对于CDI感染的发生、发展至关重要[2]。因此，对于CDI的诊断应当基于毒素的检测，而不仅仅是细菌的鉴定。

对产毒素CD的快速检测是采取及时的感染控制措施和适当治疗的关键。2010年美国卫生保健流行病学会(Society for Healthcare Epidemiology of America, SHEA)和美国感染病学会(Infectious Diseases Society of America,IDSA)发表了对于CDI患者的管理指南[3]，该指南对诊断方法进行了说明，认为只应对腹泻患者的粪便样本进行检测，对无症状患者不应进行CD相关的实验室检查与治疗。其推荐的实验室诊断方法包括产毒素的CD培养、毒素A/B酶免疫分析法、细胞培养毒素中和试验、两步法及核酸扩增法等，其中核酸扩增法具有广阔的应用前景。实验室检查是艰难梭菌相关性腹泻诊断、治疗及预防控制过程中的重要依据。最常用的酶免疫分析法简单、快速但缺乏灵敏性，而更敏感的毒素中和实验及产毒素CD培养费时费力无法满足临床要求。近年来，分子生物学方法的快速发展，以XpertC.difficile、illumigeneC.Difficile、BD MAX C.diff等为代表的CD诊断新方法缩短了检测周期，且灵敏度非常高，为CDI的诊治提供了新的手段，具有广阔的应用前景。为更好地了解CD感染实验室诊断，现就CD的检测方法做一综述。

1 细胞培养毒素中和试验(cell culture cytotoxicity neutralization assay, CCNA)

一直以来，CCNA被认为是CDI实验室诊断的金标准，原理为直接检测由毒素所致单层培养细胞的变性、坏死、凋亡等细胞病变效应。由于其操作复杂，主观性强，对实验环境及条件要求苛刻，难以标准化，且比较昂贵，故难以在临床上推广使用。且近年来随着产毒素CD培养及分子生物学方法的发展，其作为“金标准”的地位受到了挑战。研究[4-5]表明，与核酸扩增法和产毒素的CD培养相比，CCNA的灵敏度较低，普遍低于90%。

2 产毒素的CD培养(toxigenic culture, TC)

近年来，随着CDI发病率的不断增高，高致病性的新菌株型别的产生迫使实验室再次关注发展细菌培养，以寻求新的检测方法。传统的CD培养是将粪便标本直接接种于环丝氨酸头孢西丁果糖琼脂(cycloserine-cefoxitin fructose agar，CCFA)[6]培养基上厌氧培养48 h。后来在此基础上做了许多改进，包括加入马血、牛磺胆酸盐和溶解酵素等以促进孢子的萌发，提高灵敏度。另外，在培养之前将粪便用乙醇冲击或加热处理，杀灭其他细菌，有利于孢子富集。和直接接种相比，肉汤富集培养可提高敏感度约20%[7]。

另外，显色培养基也被用于CD的培养及鉴定。BioMérieux先后开发了IDCd培养基，CLO培养基和chromIDC.diffile(CDIF)培养基[8]。Eckert等[9]比较了CCFA48 h、CLO48 h、CDIF 24 h与48 h 4种培养基的性能，以4种培养基混合培养作为金标准，得出其灵敏度分别为70.4%、85.2%、74.1%和87%。而Carson等[8]从培养时间，是否进行乙醇冲击前处理等方面进一步比较了CCFA与CDIF培养基的性能，发现对谷氨酸脱氢酶阳性的粪便样本在CDIF上直接培养和经乙醇冲击前处理后培养的灵敏度和复苏率一致，而在CCFA上经乙醇冲击前处理后培养比直接培养灵敏度和复苏率高10%。在CDIF上培养24 h与48 h的结果比较，CCFA与CDIF上均培养48 h后的结果比较，差异均存在统计学意义，由此进一步说明了CDIF用于CD培养、鉴定和核糖体分型方面的优势。

由于只有产毒素的CD才具有致病性，因此，对于培养阳性并鉴定为CD的菌落还需进行毒素检测。产毒素的CD培养操作繁琐且耗时较长，但其优点为灵敏度高、可获得菌株，分离菌可进一步用于基因分型，获知细菌传播机制，是流行病学研究的基础。目前，一般作为金标准用于新检测方法的评估、临床耐药监测以及评估新的治疗方法，偶尔也可用于患者的管理。

3 酶免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测毒素

目前，国内大部分实验室均采用ELISA法检测CD毒素A和B，该方法耗时短，成本低，特异性高，但因其敏感性较低而逐渐被认为是次选方法。Planche等[10]对英国临床实验室常用的6种ELISA试剂盒性能评价的文章进行系统综述，最终发现各种试剂盒的诊断性能指标间存在差异，认为可能与各方法选择的cut off值不同有关。按照文章中作者提出的将灵敏度90%和假阳性率低于3%作为可接受的标准，6种检测试剂盒均不能满足该标准，由此作者得出结论，ELISA检测毒素不能单独作为CDI的常规实验室诊断方法。

Eastwood等[11]采用6种ELISA检测600例腹泻患者的粪便样本，并进行3种横向分析，以产毒素的CD培养作为金标准，得出灵敏度在60%～81%之间，特异度在91%～99.4%之间。同样无一种方法的结果满足Planche等[10]提出的标准，另外，文章也提到不一致的检测结果不能通过重复试验纠正，由此提出，若需要重复实验，建议选择另外一种检测方法。其他研究[12]同样提出了重复检测的限制性。

4 谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)

GDH为CD表面大量表达的抗原性酶蛋白，产生数量高于毒素且具有较强稳定性，可作为粪便中CD存在的标志物。检测GDH抗原具有非常高的敏感性和阴性预测值，早期研究[13]报道，该方法的灵敏度高于90%，阴性预测值可达99%，可作为GDH检测的首选筛查方法。然而，最近研究[14]发现，对于非流行性BI/NAP1/027菌株，GDH的检测灵敏度可能仅69%左右。另外，由于产毒和非产毒CD以及梭菌属其他种类细菌均可产生此酶，GDH检测缺少特异性，故不能单独作为快速诊断CD的首选方法，而通常将其作为两步法或三步法的初筛实验应用于临床。

TheC.DiffQUIK Chek Complete Assay (TechLab, Blacksburg，VA, USA)[15]将GDH抗原检测和毒素A&B检测结合起来，能够在30 min左右获得结果。Kim等[16]评价该方法，阴性预测值达98.5%，GDH检测部分的灵敏度是91%，而毒素检测部分的灵敏度较低(61%～78%)。因此，实验室可能需要另一种更敏感的方法检测GDH阳性而毒素阴性的情况，分子生物学无疑是最好的选择。

5 核酸扩增法(nucleic acid amplification test, NAAT)

CD毒素A和毒素B分别由tcdA和tcdB基因编码，而其表达被认为是由tcdC基因下调或缺陷引起的。基因检测可预测产毒性CD的存在，及其产毒能力的强弱。目前，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)方法主要应用于实时荧光定量PCR，RT-PCR和环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等检测粪便标本中的产毒素CD，上述方法的敏感性高，特异性强，更方便、快速，但价格昂贵，并且由于其敏感性高，一些无症状携带者在检测中也可能为阳性。Deshpande等[17]对1995—2010年发表的以CCNA或TC为金标准评价实时PCR检测性能的文章(其中19篇符合标准)进行meta分析。PCR的合并灵敏度为90%，特异度为96%。诊断方法的准确度与CD的流行率有关，在CD流行率分别为<10%，10%～20%和>20%时，阳性预测值和阴性预测值分别为71%、79%，93%、99%，98%、96%，因此，可认为实时PCR对于CDI的诊断具有较高的灵敏度和特异度。

截至目前，美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准了9种CD分子检测平台[18]，包括BD GeneOhm、BD Max、ProDesse ProGastro Cd Assay、Cepheid GeneXpertC.difficileAssay、Meridian Illumigene、Focus Technologies Simplexa、Great Basin Portrait Analyzer、Quidel AmpliVueC.difficileAssay、Nanosphere Verigene，其中Meridian Illumigene和Quidel AmpliVueC.difficileAssay检测的是毒素A基因，其他均检测的是毒素B基因。另外，FDA批准的上述检测平台中仅Meridian Illumigene采用的是环介导等温扩增技术。各检测方法的性能比较见表1。

表1 FDA批准的9种NAATs检测试剂盒的性能比较[18]

BD-GeneOhmTM C.diff是第一个被FDA批准的分子检测方法，是一个基于实时PCR检测CD毒素B基因的平台。该方法采用专用珠子溶菌手工提取DNA后，在Cepheid Smart Cycler上进行扩增，其检测结果约在2 h后给出[19]。根据参比方法的不同其灵敏度为84%～96%，特异度为94%～99%。

Cepheid GeneXpertC.difficileAssay需要在其专门的仪器GeneXpert中完成检测，该诊断方法采用全自动实时荧光定量PCR原理，将样品处理、核酸扩增、目标序列的实时检测整合于一体，能在50 min内检测患者粪便中CD产生的毒素B，甚至二元毒素，提供流行病学信息，有助于患者的早期治疗及感染预防控制。Bababy等[20]对一所肿瘤医院的560份粪便标本进行检测，将该方法与两步法(用酶免疫法检测GDH作为初筛，阳性标本再用毒素中和试验进一步证实)进行比较，该研究分两个阶段，第一阶段仅对GDH阳性标本同时用Xpert PCR和CCNA实验进行检测，结果不一致者再行粪便培养和细胞毒性检测进一步验证，结果GDH-Xpert PCR和GDH-CCNA的一致率为72%，其敏感度和特异度分别为100%和97%，57%和97%。第二阶段则分别用Xpert PCR和GDH-CCNA检测，一致率为95%。另外，对其中45份Xpert PCR检测阳性的标本进行基因分型，并与PCR-核糖体分型、基因测序进行比较，一致性可达90%以上。由此可见，Xpert PCR检测CDI具有较高的敏感度和特异度，加之其基因分型能力，检测快速、方便，极大地满足了临床需求。

Viala等[21]评价3种检测粪便中CD毒素基因的分子诊断试剂盒性能，以TC作为金标准，检测当地一所医院的89份粪便标本，最终得出，BD GeneOhmC.diff、XpertC.Difficile和illumigeneC.diff3种方法的灵敏度分别为95.5%、97.8%和86.7%，特异度分别为97.9%、97.9%和100%，准确度分别为96.8%、97.9%和93.6%。XpertC.Difficile和illumigeneC.Difficile仅需1 h便可完成检测，而BD GeneOhmC.diff需花费2～3 h，综合来看，XpertC.diff性能更佳，应用于临床优势更明显。

2012年Le等[22]提出一种新的全自动实时PCR检测CD毒素B基因的方法—BD MAXC.diff(Becton, Dickinson, Franklin Lakes, NJ)。它与XpertC.difficile操作基本相同，取约10 μL粪便至BD MAX样品缓冲管中，震荡混匀后放入BD MAX仪器中，DNA提取(50～90 min，取决于样本中可提取DNA的量)和实时PCR过程(30 min)均通过仪器自动完成。Le等[22]检测360例腹泻患者的粪便样本，以TC为金标准，得出BD MAX C.diff的灵敏度和特异度分别为97.73%、99.68%。以TC为金标准，比较Cepheid GeneXpert、BD MAX 2种全自动CD分子诊断方法[23]，其灵敏度和特异度比较，差异无统计学意义。两者具有全封闭系统、全自动操作、污染可能性小、人为错误少、结果精确度高、检测时间短等优点，因此，均可作为全自动快速分子诊断方法应用于CDI诊断。但XpertC.diff一次性可同时检测的样本量取决于GeneXpert仪器的大小规格，与GeneXpert相比，BD MAX仪器最大的优势在于在相同的PCR平台上，可同时进行24个样本的检测[23]。

上述几种NAATs检测方法虽然基本原理、操作过程及花费时间等有所区别，但检测的灵敏度和特异度均非常高，且差异无统计学意义，但目前尚无文献对新的检测方法做系统综述。值得肯定的是，分子生物学方法与产毒素CD培养的结果一致性高，且优于CCNA，ELISA和两步法。但需要指出的是，该种方法检测CD毒素基因，对无症状携带者CDI的诊断可能会存在问题。文献[24]报道，分子生物学方法的使用可能会使CDI的发病率增高50%以上，此外，上述几种FDA批准的分子检测方法可能对实验室的设备条件及工作人员有较高的专业要求。尽管如此，该方法仍是目前实验室应用最广泛的方法。

综上所述，产毒素CD培养作为CDI诊断的金标准，其在流行病学调查、耐药监测及方法评估等方面的作用是无法替代的，但因该方法自身的局限性尚不能很好的满足临床需要。基于GDH检测的两步法或三步法优于ELISA检测毒素，可应用于临床。而分子生物学方法无疑是当前较好的CDI检测方法，可与GDH检测联用也可单独用于CD毒素的检测，但其检测性能及成本效益还需进一步研究。因此，在现有CD诊断方法尚存缺陷的今天，各种方法取长补短，互相补充，可以为CD相关性腹泻的诊治提供有力依据。

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(本文编辑：曾翠)

Advances in laboratory testing forClostridiumdifficileinfection

(Institute of Clinical Laboratory Medicine, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)

2016-06-18

刘昊(1989-),男(汉族)，陕西省西安市人，检验技师，主要从事感染性疾病的实验室诊断。

徐修礼 E-mail：xxlxxl@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.01.022

R378.8

A

1671-9638(2017)01-0089-05