酸性氧化电位水对铜绿假单胞菌的杀菌机制研究

赵凯丽，李武平，张晓娜，王 刚，庄玉晨

(1. 第四军医大学西京医院，陕西 西安 710032; 2. 第四军医大学西京皮肤医院，陕西 西安 710032)

·论著·

酸性氧化电位水对铜绿假单胞菌的杀菌机制研究

赵凯丽1，李武平1，张晓娜1，王 刚2，庄玉晨2

(1. 第四军医大学西京医院，陕西 西安 710032; 2. 第四军医大学西京皮肤医院，陕西 西安 710032)

目的 探讨酸性氧化电位水(EOW)对铜绿假单胞菌的杀菌机制。方法 以铜绿假单胞菌作为研究对象，从蛋白质渗漏，核酸和细胞膜钙离子通透性等方面对EOW的杀菌机制进行研究，同时以2%戊二醛作为阳性对照组，以生理盐水(NS)作为阴性对照组。结果 以EOW、2%戊二醛对铜绿假单胞菌作用30 s杀灭率>99.99%，作用60 s杀灭率可达100.00%。EOW、NS、2%戊二醛作用铜绿假单胞菌60 s后，经BCA法检测蛋白渗漏，分别为(96.00±7.42)、(94.15±7.49)、(216.97±10.35)μg/mL，总体比较，差异有统计学意义(F=613.20，P<0.01)，2%戊二醛组高于EOW组、NS组；蛋白渗漏量不随作用时间增加而改变(均P>0.05)。随机多态性扩增DNA电泳图谱显示，EOW组与NS组均在500～1 000 kb间显示亮度较高的密集条带，2%戊二醛组无扩增条带。EOW及2%戊二醛作用后钙离子荧光强度均低于NS组。结论 EOW可能的杀菌机制是使铜绿假单胞菌细胞膜通透性受到一定程度的损伤，致使 Ca2+泄漏，但未能造成蛋白质泄漏，对其核酸损伤作用不明显，DNA可能并非EOW杀菌靶点。

酸性氧化电位水；戊二醛；铜绿假单胞菌；杀菌机制；蛋白质泄漏；核酸；细胞膜通透性

[Chin J Infect Control，2017，16(1)：41-45]

酸性氧化电位水(electrolyzed oxidizing water，EOW)自1987年由日本研发问世后，其以安全、高效、环保等优点，在抗感染方面，包括国内外医疗，食品等领域均发挥了显著效果。以往对于EOW杀菌机制的研究主要侧重于某一理化性质，认为EOW中起主导作用的杀菌因素包括低酸性，高氧化还原电位ORP，活性氧以及有效氯[1]，其中有效氯起主导作用。EOW 使细菌胞壁皱缩降解，进而胞质内蛋白质变性酶失活[2]；抑制了细胞呼吸作用，降低了细胞膜上的Na+/K+-ATP 酶活性，导致细胞内大分子物质泄漏[3]。关于EOW杀菌机制尚无统一定论，存在争议，还需进一步深入研究。本实验以铜绿假单胞菌作为研究对象，从蛋白质渗漏，核酸和细胞膜钙离子通透性等方面对EOW的杀菌机制进行研究，同时以2%戊二醛作为阳性对照组，以生理盐水(normal saline，NS)作为阴性对照组进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器 铜绿假单胞菌ATCC 15442由第四军医大学附属西京医院检验科提供。EOW由酸性氧化电位水生成器日本圣太科(规格型号SONTECH-1000)生成，2%戊二醛购于山东利尔康有限公司，SX-610型笔式pH计和ORP检测笔，有效氯检测仪SJ/S-CL501C，天根细菌DNA提取试剂盒，天根BCA蛋白质定量试剂盒，随机引物序列设计参照文献[4]，为5’-AGCGGGCCAA-3’，由上海生工生物工程有限公司合成引物，普通 PCR仪MyCycler，cwbio2×Taq MasterMix购于北京康为世纪，碧云天生物技术Fluo-3 AM(钙离子荧光探针)，酶标仪Model680，紫外分光度计DU-530。图像处理采用image J软件。

1.2 中和剂鉴定试验 试验菌铜绿假单胞菌为ATCC 15442，EOW中和剂为1%硫代硫酸钠，2%戊二醛中和剂为甘氨酸+吐温100+卵磷脂，中和剂均用PBS配制后经高压蒸汽灭菌，进行中和剂鉴定。根据2002版《消毒技术规范》试验平行设置6组。

1.3 杀菌效果测定 取24 h细菌新鲜培养液，配制试验用菌悬液，取 1 mL菌悬液加入至9 mL消毒剂中，混匀，分别作用60、120 s后，立即取1 mL混合液加入到9 mL中和剂中作用10 min，对照组用NS进行同样操作。吸取0.2 mL采用平板倾注计数法进行菌落总数测定，TSA培养基37 ℃培养24 h后，进行菌落计数，试验重复3次。

1.4 蛋白渗漏量测定

1.4.1 样本制备 配制实验用菌悬液，取4支无菌试管中分别加入0.5 mL菌悬液，试验组分别加入4.5 mL EOW(pH=2.7)、2%戊二醛及NS，作用至预定时间后，分别经φ=0.22 μm微孔滤过膜滤过，取滤液备用。

1.4.2 二喹啉甲酸法(BCA法)标准蛋白配制及测定 参照天根BCA蛋白定量试剂盒说明书：(1)用NS稀释标准品；(2)根据样本数量按50∶1配制BCA工作液，充分混匀；(3)吸取25 μL BSA标准液和待测细菌滤液加入到96孔板；(4)每孔加入220 μL BCA工作液，混匀，加盖37℃孵育30 min后冷却至室温，酶标仪检测562 nm处吸光度。(5)以OD值为横坐标，标准蛋白浓度为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线计算3组蛋白渗漏量。

1.5 对铜绿假单胞菌DNA的作用

1.5.1 对铜绿假单胞菌提纯DNA的作用 DNA样本制备：取24 h新鲜细菌培养液，参照天根细菌DNA基因组提取试剂盒说明书进行DNA提取。取1 μL 提纯DNA，分别加入至9 μL EOW、2%戊二醛、NS中作用60 s，迅速加入至90 μL 中和剂混匀，作用10 min备用。

1.5.2 铜绿假单胞菌随机多态性扩增 随机引物5’-AGCGGGCCAA-3’，10 μL 反应体系：引物2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 1 μL，Taq MasterMix 6 μL；扩增条件：94℃ 2.5 min，变性94℃45 s，退火41℃ 1 min，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环，72℃ 5 min，扩增完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 对铜绿假单胞菌细胞膜通透性的作用 制备菌悬液，取100 μL 分别加入至900 μL EOW、2%戊二醛及NS中混匀，作用60 s后取混合液100 μL 分别加入到900 μL 中和剂中作用10 min，每管避光加1 μL 荧光探针Fluo-3AM，使其终浓度5 μmol/L，震荡混匀后置于37℃恒温箱孵育45 min进行探针装载，装载完成后将各管离心8 000 r/min，3 min，弃上清后加入1 000 μL 无菌PBS缓冲液漂洗2次，进行激光共聚焦观察。

2 结果

2.1 中和剂鉴定结果 中和剂鉴定结果显示，第1组无菌生长，第2组菌落生长较第1组多，第3、4、5组菌落生长数比较，差异无统计学意义，第6组无菌生长。EOW组间菌落数误差率为9.112%，2%戊二醛组间菌落误差率为9.086%，中和剂鉴定合格。见表1。

2.2 杀菌试验结果 以EOW(pH=2.7，有效氯含量40 mg/L)及2%戊二醛对铜绿假单胞菌标准菌株ATCC 15442作用30 s杀灭率>99.99%，作用60 s杀灭率可达100.00%，两种消毒剂对铜绿假单胞菌杀菌效果比较，差异无统计学意义(P>0.05)。NS对照组平均菌落数为20.20×106CFU/mL。

表1 不同组别中和剂鉴定结果(平均回收菌落数，×106CFU/mL)

Table 1 Identification results of neutralizer in different groups (Average number of recovered bacteria, ×106CFU/mL)

实验分组EOW组2%戊二醛组第1组:消毒剂+菌悬液00第2组:(消毒剂+菌悬液)+中和剂7.99.2第3组:中和剂+菌悬液21.920.1第4组:(消毒剂+中和剂)+菌悬液18.621.7第5组:稀释液+菌悬液17.316.9第6组:稀释液+中和剂+培养基00

2.3 蛋白质渗漏测定结果 EOW、NS、2%戊二醛作用铜绿假单胞菌60 s后，经BCA法检测蛋白渗漏，分别为(96.00±7.42)、(94.15±7.49)、(216.97±10.35)μg/mL，总体比较，差异有统计学意义(F=613.20，P<0.01)，2%戊二醛组高于EOW组、NS组。蛋白渗漏量不随作用时间增加而改变(均P>0.05)。见表2、图1～2。

表2 铜绿假单胞菌EOW、2%戊二醛及NS作用不同时间后蛋白渗漏情况±s，μg/mL)

***：表示差异有统计学意义；ns：表示差异无统计学意义

图1 铜绿假单胞菌EOW、2%戊二醛及NS作用60 s后蛋白渗漏情况(μg/mL)

Figure 1 Protein leakage ofP.aeruginosaafter 60-second contact with EOW, 2% glutaraldehyde, and NS(μg/mL)

图2 铜绿假单胞菌EOW、2%戊二醛及NS作用不同时间后蛋白渗漏情况

Figure 2 Protein leakage ofP.aeruginosaafter different contact time with EOW, 2% glutaraldehyde, and NS(μg/mL)

2.4 对铜绿假单胞菌DNA的作用结果 EOW作用于铜绿假单胞菌DNA 60 s后，经扩增后于电泳检测两组DNA指纹图谱，均在500～1 000 kb间显示亮度较高的密集条带。2%戊二醛作用后的铜绿假单胞菌DNA经PCR扩增电泳检测无DNA条带显示。见图3。

2.5 对铜绿假单胞菌作用后细胞膜钙离子通透性测定结果 激光共聚焦结果显示，EOW、2%戊二醛、NS处理后铜绿假单胞菌钙离子荧光强度分别为40.50±4.42、47.63±3.77、1 903.75±16.12，总体比较，差异有统计学意义(F=82 580，P<0.01)，EOW组、2%戊二醛组均低于NS组，仅散在分布于各视野。见图4。

EOW：为酸性氧化电位水；GLU：为2%戊二醛；NS：为生理盐水；编号1、2、3为三组样本：M为分子量为2 000kb的DNAmarker

图3 EOW、2%戊二醛及NS对铜绿假单胞菌DNA作用后PCR扩增电泳图谱

Figure 3 Electrophoresis map of PCR amplifiedP.aeruginosaDNA after contact with EOW, 2% glutaraldehyde, and NS

a:EOW;b:2%戊二醛;c:NS

3 讨论

3.1 EOW对铜绿假单胞菌胞内蛋白质渗漏的作用情况 EOW独特的理化性质(pH<3，高ORP>1 100 mv，低浓度有效氯30～60 mg/L)使其杀菌能力非单一因素所决定，文献[5]已报道中性EOW灭菌效果未发生改变，而有效氯浓度改变很大程度影响了其灭菌效果。氯可氧化细菌-SH基，次氯酸盐可与胞质成分作用形成氮氯复合物干扰细胞代谢，而胞内物质的渗漏与细菌致死并无确切联系[6]。铜绿假单胞菌属革兰阴性细菌，其细胞壁的外膜及细胞膜上均镶嵌有蛋白质大分子，并且胞膜内包裹的细胞质由水、蛋白质、脂类、核酸及少量糖和无机盐组成，若EOW使其细胞外膜破裂，则细菌滤液中会有蛋白质渗漏[1]，通过BCA法检测的蛋白质渗漏量应高于对照组，结果显示，EOW作用60 s后与NS组相比蛋白渗漏差异无统计学意义，而2%戊二醛组蛋白渗漏高于EOW及NS组，为排除作用时间对结果的影响，于不同作用时间后经BCA测定，结果显示，3组蛋白质渗漏量未呈现出随时间改变趋势，推测EOW的杀菌机制可能不是使细菌细胞壁细胞膜破裂蛋白大分子渗漏。

3.2 EOW对铜绿假单胞菌核酸的作用情况 随机扩增多态性DNA，无需专门设计特定引物，由于随机引物在较低的复性温下能与基因组DNA非特异性的结合，当相邻两个引物间DNA小于2 000 bp时，就能得到扩增产物，可检测由于碱基发生缺失、插入、突变、重排等所引发的DNA多态性[7]。戊二醛的杀菌机制是对细菌蛋白质和核酸的烷化作用，烷化后G(鸟嘌呤)发生改变导致和T错配；G结构破坏；DNA不能复制，且DNA断裂，因此经2%戊二醛作用后的铜绿假单胞菌DNA无法进行PCR，而EOW作用后DNA指纹图谱与对照组无差异，推测EOW未使铜绿的DNA发生断裂损伤。此结论与以往文献[8]报道，EOW作用后细菌DNA 的限制性片段多态性并未改变相符。DNA损伤是一个极其复杂的过程，损伤类型包括点突变、缺失、插入、倒位或转位、双链断裂等，更进一步判断DNA损伤类型需进行DNA序列检测。

3.3 EOW对铜绿假单胞菌细胞膜通透性的作用情况 细菌的生命状态与其细胞膜通透性密切相关，反映膜通透性改变的指标包括细胞内Ca2+、K+、Na+、Mg2+、核酸、蛋白质等。已证实EOW将造成细菌超微结构改变，细胞壁皱缩、酶失活、胞质内DNA及K+渗漏[9]。Ca2+作为重要的第二信使，调节着细胞功能，其浓度变化可预示细菌的存亡。Fluo-3 AM是一种新型高度特异性Ca2+荧光指示剂，只有进入细胞后经非特异性酯酶脱去AM酯成为脂溶性Fluo-3后留在细胞内与游离Ca2+结合在激发光激发后被检测到，其荧光强度与Ca2+浓度成正比。激光共聚焦结果显示，EOW和2%戊二醛使得铜绿假单胞菌胞内Ca2+含量低于NS，推测EOW作用后铜绿假单胞菌细胞膜Ca2+通道发生改变，引起Ca2+外漏，最终导致或促进细菌死亡。

综上所述，细菌细胞壁及核酸并非EOW的主要作用靶点，细胞膜通透性改变导致重要离子外漏是导致细菌死亡的原因之一。此外，可能的杀菌机制包括干扰细菌代谢，使酶失活等还有待进一步研究。

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(本文编辑：文细毛)

Bactericidal mechanism of electrolyzed oxidizing water againstPseudomonasaeruginosa

ZHAOKai-li1,LIWu-ping1,ZHANGXiao-na1,WANGGang2，ZHUANGYu-chen2

(1XijingHospital，FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032，China； 2XijingSkinHospital，FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China)

Objective To investigate the bactericidal mechanism of electrolyzed oxidizing water (EOW) againstPseudomonaaeruginosa(P.aeruginosa).Methods Bactericidal mechanism of EOW againstP.aeruginosawas studied through intracellular protein leakage, nucleic acid,and cell membrane calcium ion permeability, 2% glutaraldehyde was used as positive control group, and normal saline (NS) was used as negative control group.Results The killing rates of EOW and 2% glutaraldehyde toP.aeruginosawere both>99.99% with 30-second contact time, and 100.00% with 60-second contact time. After 60-second contact with EOW, NS, and 2% glutaraldehyde，the protein leakage ofP.aeruginosadetected by bicinchoninic acid (BCA) were (96.00±7.42),(94.15±7.49), and (216.97±10.35)μg/mL, respectively, difference was significant(F=613.20，P<0.01)，2% glutaraldehyde group was higher than EOW group and NS group; protein leakage did not change with the increase of contact time(allP>0.05). Electrophoretogram of random amplified polymorphic DNA showed high intensity dense band between 500-1000 Kb in EOW group and NS group, while 2% glutaraldehyde group was without amplified bands. The fluorescence intensity of calcium ion of EOW group and 2% glutaraldehyde group were both lower than that of NS group.Conclusion Bactericidal mechanism of EOW may be due to the damage of membrane permeability ofP.aeruginosa, which causes Ca2+leakage, but fails to cause protein leakage, the damage to nucleic acid is not obvious, DNA may not be a bactericidal target of EOW.

electrolyzed oxidizing water; glutaraldehyde;Pseudomonasaeruginosa; bactericidal mechanism; protein leakage; nucleic acid; cell membrane permeability

2016-06-01

赵凯丽(1991-)，女(回族)，甘肃省天水市人，硕士研究生，主要从事重症监护与医院感染研究。

李武平 E-mail:liwuping@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.01.009

R187

A

1671-9638(2017)01-0041-05