Legumain基因在斑马鱼胚胎发育中的表达分析

贾小娥，朱 伟，樊 燕，谢 伟，姜树原，石 蕊，刘晓蕾，许文强，邵 国

(1.包头医学院生物医学研究中心，内蒙古包头 014060；2.包头医学院药学院，内蒙古包头 014060；3.包头医学院基础学院，内蒙古包头 014060)

Legumain基因在斑马鱼胚胎发育中的表达分析

贾小娥1△，朱 伟2△，樊 燕3，谢 伟1，姜树原1，石 蕊1，刘晓蕾1，许文强1，邵 国1

(1.包头医学院生物医学研究中心，内蒙古包头 014060；2.包头医学院药学院，内蒙古包头 014060；3.包头医学院基础学院，内蒙古包头 014060)

为明确天冬酰胺内肽酶(legumain)基因在斑马鱼发育中的表达特性，利用全胚胎原位杂交的方法检测legumain在斑马鱼胚胎发育过程中的表达分布情况，并采用双色原位杂交的方法研究legumain和泛髓系细胞、巨噬细胞、中性粒细胞的共定位情况。结果显示，legumain转录本为母系表达，在胚胎发育早期泛在性表达。在受精18 h后在造血组织有特异的高丰度表达。双色原位杂交显示，legumain和泛髓系细胞、巨噬细胞、中性粒细胞有共定位表达。结果提示legumain在斑马鱼发育过程中有重要作用，在巨噬细胞中高表达并参与相关生理功能的完成。

天冬酰胺内肽酶；斑马鱼；胚胎发育；表达特性；共定位

天冬酰胺内肽酶(legumain，LGMN)是半胱氨酸蛋白酶家族的新成员。最早在植物刀豆和豇豆中发现，随后研究人员发现在脊椎动物、哺乳动物中均有legumain的表达。legumain和其他家族的组织蛋白酶一样，主要定位于细胞的溶酶体中，参与降解基质蛋白等多种生理过程[1-2]。

研究表明，legumain基因在多种肿瘤组织中高表达[3-5]，并且legumain的高表达与肿瘤的分化程度、肿瘤的发生发展、肿瘤的浸润和转移有密切的关系[6-7]。更多的研究表明，legumain不仅在肿瘤细胞中高表达，在肿瘤微环境和肿瘤相关的巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)中也高表达[8]。

然而关于legumain在机体正常发育过程中和正常组织中的作用研究相对较少。本研究以斑马鱼作为模式生物，研究legumain在胚胎发育中的表达特性。研究发现，legumain基因为母系表达基因，早期胚胎发育时期泛在性表达，在受精18 h后在造血组织有特异的高丰度表达。双色原位杂交显示，legumain和泛髓系细胞(pan myeloid cells)、巨噬细胞、中性粒细胞有共定位表达。结果为进一步研究legumain在胚胎发育中的功能研究奠定了基础，并为legumain在巨噬细胞中的功能研究提供了试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 试验用斑马鱼为Tubigen系野生型斑马鱼，由包头医学院斑马鱼模式动物平台保种并饲养，14 h光照/10 h黑暗交替循环，水温28.5 ℃±0.5 ℃，pH 7.2～7.5。

1.1.2 质粒和引物 pGEM-Teasy载体为Promega公司产品；引物zlegumain-F:TGTCGAATTCGCAGAAATGAGCCCAAAGAC，zlegumain-R:GAGACTCGAGCCCCCTTCAGTTCAGTTT- CA，产物大小为2 133 bp，用于扩增legumain基因，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.1.3 主要试剂 限制性内切酶EcoRⅠ、SacⅡ、DNA聚合酶、rTaq、质粒小提试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒、DNA连接试剂盒、逆转录试剂盒，Takara公司产品；mMESSAGE mMACHINE○RSP6 Transcription Kit (Ambion, AM1340)，NucAway Spin Columns(Ambion, AM10070)，Dig RNA Labeling Mixture (Roche, 11277073910), Fluorescein RNA Labeling Mix (Roche,11685619910)。

1.2 方法

1.2.1 质粒构建 提取斑马鱼组织总RNA，反转录为cDNA，以此cDNA为模版，用zlegumain-F和zlegumain-R进行PCR扩增，得到legumain基因片段。将扩增得到的legumain基因片段连接到pGEM-T easy载体中，然后转化到DH5α感受态细胞中。筛选阳性克隆，阳性克隆培养并提取质粒后经EcoRⅠ酶切鉴定后测序验证,正确的质粒命名为zlegumain-pGEM-T easy。

1.2.2 地高辛或荧光素标记的反义mRNA探针的制备 合成探针时，以限制性内切酶SacⅡ线性化的zlegumain-pGEM-T easy质粒为模板，用 SP6 RNA聚合酶体外转录得到反义RNA探针。探针体外转录采用RNA地高辛/荧光素标记试剂盒(DIG/ Fluorescein RNA Labeling Kit，Roche)，步骤参照试剂盒说明书。合成的探针用 NucAway Spin Columns进行纯化，经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后，置-80℃保存。

1.2.3 斑马鱼整体胚胎原位杂交 选取野生型斑马鱼发育至0.75、1.5 、3.7、6、12、18、22、36、48、72 h的胚胎进行原位杂交，40 mL/L甲醛4℃固定过夜，甲醇梯度脱水，置于-20℃ 100%甲醇中备用。甲醇梯度复水，蛋白酶K处理，用1×PBST洗去消化液后，40 mL/L甲醛再次固定20 min,1×PBST洗3次。将胚胎置于68℃杂交炉中预杂交2 h，然后加入legumain反义RNA探针于68℃杂交炉中杂交过夜。杂交后第2天回收探针并加入SSCT梯度清洗胚胎，加入anti-Dig-AP抗体与反义探针4℃结合过夜。杂交后第3天用1×PBST洗去多余抗体，加入显色试剂 BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Substrate(Vector labs)溶液,避光室温轻摇染色，每隔20 min观测显色情况。染色结束后，PBST洗净染液，在体视显微镜下(Nikon SMZ18)观察记录结果并拍照。

1.2.4 斑马鱼整体胚胎双色原位杂交 试验步骤同单色原位杂交。双色原位杂交时第1天需要加入地高辛标记的和荧光素标记的反义RNA探针，双色原位杂交第2天还需要加入抗荧光素的抗体，双色原位杂交第3天在用BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Substrate溶液显色后，再使用Fast Red Tablets进行显色。

2 结果

2.1 legumain探针质粒的构建和鉴定

利用设计的引物扩增得到legumain基因片段，连接入pGEM-Teasy载体，得到用于合成legumain反义探针的重组载体zlegumain-pGEM-Teasy，载体包括legumain基因的CDS区域和部分3′UTR区域(图1A)。使用EcoRⅠ内切酶对zlegumain-pGEM-Teasy进行酶切鉴定。经琼脂糖电泳发现，质粒被切成线性，分别为3 015 bp的pGEM-Teasy载体骨架和2 133 bp legumain片段，表明重组载体中正确插入了legumain基因片段(图1B)。随后送公司测序表明，legumain片段与NCBI上序列一致，证实legumain探针质粒构建成功。

A.legumain探针质粒图谱； B.EcoRⅠ酶切鉴定质粒；M.DNA标准DL 15 000；1～3.zlegumain-pGEM-Teasy

A.The map of zlegumain-pGEM-Teasy; B.The digestion of zlegumain-pGEM-Teasy byEcoRⅠ; M.DNA Marker DL 15 000; 1-3.zlegumain-pGEM-Teasy

图1 legumain探针质粒的构建和鉴定

Fig.1 The construction and identification of legumain probe plasmid

2.2 legumain同源性分析

对斑马鱼和人类的legumain基因进行了同线性分析(synteny analysis)，结果显示，在斑马鱼13号染色体上包含legumain基因及其上、下游6个基因在内的基因组序列，同时在人类的14号染色体上完全可以找到其对应的同源区(图2A)。使用ClustalW软件对8个物种的legumain进行氨基酸序列对比，结果显示，斑马鱼legumain氨基酸序列与人的同源性为66.7%，与黑猩猩的同源性为66.7%，与大鼠的同源性为65.4%，与小鼠的同源性为66%，与鸡的同源性为69.2%，与线虫的同源性为43.5%。绘制这8个物种legumain的系统发育树如图2B。结果说明，从斑马鱼到人类的进化过程中，legumain基因是高度保守的。

2.3 legumain基因在斑马鱼胚胎中的表达谱分析

分别收集受精后0.75、1.5、3.7、6、12、18、22、36、48、72 h共10个不同发育时期的斑马鱼胚胎，进行全胚胎原位杂交，在体视显微镜下观察斑马鱼不同发育时期legumain基因的表达情况(图3)。由图3A和图3B可见，legumain基因为母系来源基因，该基因自卵裂时期就开始表达。在发育初期50%外包时期6 h时(图3C和图3D)呈现泛在性表达。在斑马鱼胚胎发育12 h时，legumain呈现体节表达(图3E)。在斑马鱼胚胎发育22 h时，legumain在早期造血组织ICM(intermediate cell mass,ICM)区域有相对特异表达(图3G)。在斑马鱼胚胎发育36 h时，legumain在定向造血组织AGM(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区域有特异表达(图3H)。在斑马鱼胚胎发育48 h～72 h时，legumain在定向造血组织CHT(caudal hematopoietic tissue,CHT)区域有特异表达(图3I和图3J)。

2.4 legumain基因和血管内皮生长因子受体flk-1的共定位分析

为了进一步证实legumain基因是否也在血管组织中表达，采用双色原位杂交技术观察legumain基因和血管内皮生长因子受体flk-1是否有共定位表达。血管内皮生长因子受体flk-1在斑马鱼全身血管内皮表达，特异性标记血管系统。图4A和图4B显示，血管内皮生长因子受体flk-1(蓝色)和legumain(红色)没有共定位表达，说明legumain基因不在血管内皮组织中表达。

A. legumain同线性分析；B. legumain系统发育树

A.Synteny analysis of legumain; B.Phylogenetic tree of legumain

图2 legumain同源性分析

Fig.2 legumain homology analysis

A、B、C、D、E、F、G、H、I、J为侧面观；D’、E’、H’为背面观

A.24 h pf时flk-1和legumain双色原位杂交；B.36 h pf时Flk-1和legumain双色原位杂交

2.5 legumain基因在造血细胞中的表达分析

Legumain不在血管内皮组织中表达，并且在造血组织AGM和CHT均有特异性的表达，那么在血液细胞中是否有legumain的表达呢？使用双色原位杂交技术观察legumain和泛髓系细胞(l-plastin标记,哺乳动物中同源基因为LCP1)、中性粒细胞(mpo标记,哺乳动物中同源基因为MPO)和巨噬细胞(lyz标记,哺乳动物中同源基因为LYZ)分别进行共定位分析。如图5所示，泛髓系细胞特异表达基因l-plastin(蓝色)和legumain(红色)在受精后36 h有共定位表达(图5A和图5B)。中性粒细胞特异表达基因mpo(蓝色)和legumain(红色)在受精后36 h有共定位表达(图5C和图5D)。巨噬细胞特异表达基因lyz(蓝色)和legumain(红色)在受精后36 h有共定位表达(图5E和图5F),而将lyz和legumain反义探针的颜色互换时，巨噬细胞特异表达基因lyz(红色)和legumain(蓝色)在受精后36 h同样有共定位表达(图5G和图5H)。说明legumain不仅在造血组织AGM和CHT表达，同时在造血细胞中也有legumain的表达。

A(24hpf)、B(36hpf)为legumain(red)和l-plastin(blue)的共定位; C(22hpf)、D(36hpf)为legumain(red)和mpo(blue)的共定位; E(24hpf)、F(36hpf)为legumain(red)和lyz(blue)的共定位; G(24hpf)、H(28hpf)为legumain(blue)和lyz(red)的共定位

A(24hpf)，B(36hpf).Co-localization of legumain (red) and l-plastin (blue); C(22hpf)，D(36hpf).Co-localization of legumain (red) and mpo (blue); E(24hpf)，F(36hpf).Co-localization of legumain (red) and lyz (blue); G(24hpf)，H(28hpf).Co-localization of legumain (blue) and lyz (red)

图5 legumain基因在泛髓系细胞、巨噬细胞和中性粒细胞中的表达

Fig.5 Expressions of legumain in pan-myeloid cells/ macrophages/ neutrophiles

3 讨论

Legumain在物种进化中高度保守，生物信息学分析表明，斑马鱼legumain蛋白质序列与部分物种中legumain的同源性达到60%以上，特别是和人类的legumain同源性达到66.7%，说明legumain在进化中的高度保守性以及重要作用。本研究以斑马鱼为模式生物，对legumain的时空表达谱进行分析，legumain在斑马鱼胚胎发育过程中具有明显的时空表达差异和组织特异性。在胚胎发育早期，legumain呈现普遍性表达，在受精22 h后特异性，表达于造血组织。这与legumain在小鼠和人类造血组织中的泛在性表达谱一致[9]，进一步说明了legumain在从斑马鱼到人类的进化过程是非常保守的。

为了更进一步说明legumain的表达特异性，本研究使用双色原位杂交的方法，证实legumain不在血管内皮细胞中表达，而是在造血细胞中表达，特别是在泛髓系细胞、巨噬细胞和中性粒细胞中有legumain的表达。这些结果提示legumain在巨噬细胞和免疫细胞中有重要作用，并可能与巨噬细胞、免疫细胞的功能相关。有报道，在单核细胞/巨噬细胞的细胞模型中，巨噬细胞表达并分泌legumain，特别是在单核细胞向巨噬细胞分化的过程中，legumain的表达和活性明显上升[10]。还有一些研究发现，legumain参与免疫细胞的抗原递呈过程[11]，并以抗原和Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)作为酶切底物参与了抗原递呈和自身免疫的激活[12]。

Legumain被认为是治疗肿瘤和抑制肿瘤转移侵袭的一个潜在靶点[3-4]，与legumain在巨噬细胞中高表达并参与巨噬细胞相关功能有直接关系。在肿瘤相关巨噬细胞中也有legumain的高表达,并且使用药物阻断TAMs能够有效抑制肿瘤的转移和侵袭[8]，在肿瘤细胞中敲除legumain，也能够有效抑制肿瘤细胞转移和侵袭[6,13]。利用legumain特异性的酶切位点以及在TAMs中特异性表达的特点，开发了legumain特异性剪切的抗肿瘤药物[14-15]，在抗肿瘤药物上连接legumain特异性剪切序列作为药物前体，这些药物前体在肿瘤细胞中被高表达的legumain剪切变成活性药物，能发挥抗肿瘤作用并杀死肿瘤细胞，能够有效的靶向肿瘤细胞，减少对正常细胞的副作用。

总之，legumain在斑马鱼胚胎正常发育中发挥了重要作用，并在巨噬细胞和其他免疫细胞中特异性表达。本研究为进一步探讨legumain在胚胎发育及疾病中的作用奠定了基础。

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Expression Pattern Analysis of Legumain Gene in Zebrafish Embryonic Development

JIA Xiao-e1,ZHU Wei2,FAN Yan3,XIE Wei1,JIANG Shu-yuan1,SHI Rui1, LIU Xiao-lei1,XU Wen-qiang1,SHAO Guo1

(1.BiomedicalResearchCenter,BaotouMedicalCollege,Baotou,InnerMongolia,014060,China; 2.SchoolofPharmacy,BaotouMedicalCollege,Baotou,InnerMongolia,014060,China; 3.SchoolofBasicMedical,BaotouMedicalCollege,Baotou,InnerMongolia,014060,China)

To explore the spatio-temporal expression pattern of legumain in the zebrafish development,whole-mount in situ hybridization (WISH) was used to detect the expression pattern of legumain in the process of zebrafish embryonic development.Double in situ hybridization (D-WISH) was performed to detect the co-localization of legumain and pan-myeloid cells/ macrophages/ neutrophiles.Legumain transcript was maternal expressed,and expressed ubiquitously in most tissues of early embryos.Then legumain transcript was specific highly expressed in hematopoietic tissue from 18 hour post fertilization (hpf).Legumain was found to co-localization with pan-myeloid cells/ macrophages/ neutrophiles using double in situ hybridization.The present study provided important clues that legumain plays an important role in embryonic development in zebrafish,and has high expression in macrophages and participates macrophage functions.

legumain; zebrafish; embryonic development; expression pattern; co-localization

2016-05-05

国家自然科学基金项目(81550038，81660204)；内蒙古自然科学基金项目(2015BS0801，2015BS0807)；包头医学院博士科研启动基金项目(BSJJ201632，BSJJ201623)；内蒙古自治区高等学校科学技术研究项目(NJZY16207)；包头医学院科学研究基金项目(BYJJ-YF 201610，BYJJ-YF 201606)

贾小娥(1984-)，女，内蒙古包头人，讲师，博士，主要从事发育生物学研究。△同等贡献作者

S852.161

A

1007-5038(2017)01-0045-05