羊布鲁菌快速检测技术应用研究

葛 婷，雷程红*，王振宝，卞赛赛，樊新丽

(1．新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2．伊犁出入境检验检疫局，新疆伊宁 835000)

羊布鲁菌快速检测技术应用研究

葛 婷1，雷程红1*，王振宝2，卞赛赛1，樊新丽1

(1．新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2．伊犁出入境检验检疫局，新疆伊宁 835000)

通过用4种方法对羊布鲁菌的检测，确立适用于基层应用的羊布鲁菌快速检测技术。http://www.mdxycn.com/采用浊度仪LAMP、金属浴LAMP、荧光目视检测试剂盒LAMP和普通PCR共4种方法对羊血液中的布鲁菌进行检测，比较其检测结果。结果表明，共检测162份羊血液，布鲁菌检出率分别为浊度仪LAMP为8.6%、金属浴LAMP为8.6%、荧光目视检测试剂盒为8.6%、普通PCR为6.2%。LAMP较普通PCR方法特异性强且灵敏度高；金属浴LAMP方法操作简便，无需特殊设备，更适用于基层应用。

羊；布鲁菌；环介导等温扩增技术；检测

布鲁菌病(Brucellosis)是由布鲁菌(Brucella)引起的以发热和流产为主要特征的人畜共患传染病。近年来，布鲁菌病频频发生，直接威胁到了人和动物的健康，造成了巨大的经济损失和严重的公共卫生危害[1]。布鲁菌病防控的关键是对病原及早、快速、准确的检测并确诊。目前，用于布鲁菌病的诊断技术有细菌分离培养、凝集试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验及PCR检测等方法[2]，但上述方法耗时长，操作较复杂，有些尚需借助精密仪器设备方能判定结果，致使这些方法在基层应用中较难普及推广。因此，建立一种适用于基层的、简便快速准确的病原诊断方法十分必要。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种能对核酸进行高效扩增，并广泛用于基因快速检测的新型检测方法[3]。LAMP方法与普通PCR方法相比，其灵敏度高，特异性强，对实验室仪器设备要求较低，操作简便。在恒温条件下(60℃～65℃)1 h内即可扩增出109～1010靶序列拷贝[4-5]，其结果可用肉眼直接判定[6-7]。目前， LAMP方法已应用于微生物基因检测[8]。本研究采用3种LAMP方法和PCR方法对羊布鲁菌进行检测比较，以期筛选出最适合于基层应用的羊布鲁菌病快速诊断技术。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 检测样品 在伊犁州部分地区随机采集绵羊血液162份。

1.1.2 菌株及DNA 布鲁菌活疫苗(M5株)，购自新疆天康畜牧生物技术股份有限公司；大肠埃希菌DNA、绿脓杆菌DNA及沙门菌DNA由新疆伊犁出入境检验检疫局实验室馈赠。

1.1.3 引物 布鲁菌IS711基因PCR引物参照SN/T1088-2010、布鲁菌Omp25蛋白基因LAMP引物参照文献[9]，由北京华大科技有限公司合成。

1.1.4 主要试剂 10×Buffer(Mg2+free)缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、DNA Marker DL 2 000，宝生物工程(大连)有限公司产品；血液基因组提取试剂盒，天根生物公司产品；BstDNA聚合酶(NEB)、SYBR Green-I核酸染料，北京鼎国生物有限公司产品；荧光目视检测试剂盒，荣研生物科技(中国)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 羊血液基因组的提取 按照血液基因组提取试剂盒的操作说明进行。

1.2.2 羊布鲁菌活疫苗(M5株)DNA的提取 参照SN/T2701-2010方法进行。

1.2.3 布鲁菌Omp25基因的金属浴LAMP扩增 反应体系为25 μL：2×反应缓冲液12.5 μL，引物混合物3.0 μL，Bst DNA聚合酶1.0 μL，模板2.0 μL，去离子水6.5 μL。反应条件：金属干浴锅设置63℃ 50 min，90℃ 10 min。反应管涡旋混匀后置于金属干浴锅中进行LAMP扩增，反应结束后，观察反应管是否有白色浑浊生成，经过6 000 r/min、5 min离心观察是否产生白色沉淀。反应体系中的模板分别为布鲁菌活疫苗(M5株)DNA(阳性对照)、双蒸水(阴性对照)及待检样品DNA。

1.2.4 布鲁菌Omp25基因的实时浊度仪LAMP扩增 反应体系为25 μL：2×反应缓冲液12.5 μL，引物混合物3.0 μL，Bst DNA聚合酶1.0 μL，模板2.0 μL，去离子水6.5 μL。反应条件：LAMP实时浊度仪设置63℃ 45 min，80℃ 10 min。反应管涡旋混匀后置于LAMP实时浊度仪中扩增。反应结束后，查看柱状图底部的颜色变化，红色为阳性，绿色为阴性。反应体系中的模板分别为双蒸水、布鲁菌活疫苗(M5株)DNA(阳性对照)、大肠埃希菌DNA(阴性对照)、绿脓杆菌DNA(阴性对照)、沙门菌DNA(阴性对照)及待检样品DNA。

1.2.5 布鲁菌Omp25基因的LAMP扩增(荧光目视检测试剂盒法) 反应体系为25 μL：2×反应缓冲液12.5 μL，引物混合物3.0 μL，Bst DNA聚合酶1.0 μL，模板2.0 μL，去离子水5.5 μL，钙黄绿素染料1 μL。反应条件：金属干浴锅设置63℃ 50min，90℃ 10 min。反应管涡旋混匀后置于金属干浴锅中扩增。反应结束后，肉眼直接观察反应管颜色变化，并用紫外线照射装置观察反应管有无荧光出现。反应体系中的模板分别为布鲁菌活疫苗(M5株)DNA(阳性对照)、双蒸水(阴性对照)及待检样品DNA。1.2.6 布鲁菌IS711基因的PCR扩增 反应体系为25 μL：模板1.5 μL，引物混合物2 μL，10×buffer(Mg2+free)缓冲液3 μL、TaqDNA聚合酶0.25 μL、dNTP Mixture2.5 μL、MgCl22 μL、去离子水13.75 μL。反应条件为：95℃ 5 min；95℃ 15 s，52℃ 30 s，72℃ 90 s，40个循环；72℃ 5 min。反应管涡旋混匀后置于PCR仪中，反应结束后，取PCR产物5 μL，15 g/L琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像仪中观察拍照。反应体系中的模板分别为布鲁菌活疫苗(M5株)DNA(阳性对照)、双蒸水(阴性对照)及待检样品DNA。

2 结果

2.1 布鲁菌Omp25基因的金属浴LAMP扩增结果

经63℃ 50 min，90℃ 10 min扩增后，阳性对照管1号和待检样品管3号出现白色浑浊，经6 000 r/min，5 mim离心后沉淀明显，结果说明布鲁菌核酸在扩增过程中产生大量焦磷酸镁白色浑浊，离心后白色沉淀明显。而阴性对照管2号和待检样品管4号未发生变化说明没有扩增出布鲁菌核酸。具体结果见图1。用该方法检测羊血液162份，检出布鲁菌14份，布鲁菌检出率为8.6%。

A.离心前;B离心后;1.阳性对照；2.阴性对照；3、4.待检样品

2.2 布鲁菌Omp25基因的实时浊度仪LAMP扩增结果

经63℃ 45 min，80℃ 10 min 在LAMP 实时浊度仪扩增后，2号通道出现蓝色柱状图且柱状图底部为红色，说明2号阳性对照管扩增出布鲁菌核酸。其他通道未出现蓝色柱状图且柱状图底部为绿色，说明阴性对照管未扩增出布鲁菌核酸(图2)。待检样品管3号所对应的3号通道出现蓝色柱状图且柱状图底部为红色，说明待检样品管3号扩增出布鲁菌核酸(图3)。

用该方法检测羊血液162份，检出布鲁菌14份，布鲁菌检出率为8.6%。

2.3 布鲁菌Omp25基因的LAMP扩增结果(荧光目视检测试剂盒法)

经金属干浴锅设置63℃ 50 min，90℃ 10 min扩增后，阳性反应管1号颜色由橙红色变为绿色，说明阳性反应管1号中扩增出布鲁菌阳性核酸。阴性反应管2号橙红色不变，说明未扩增出布鲁菌核酸。待检样品3号反应管出现绿色说明扩增出布鲁菌核酸(图4A)。使用紫外线照射装置观察结果，扩增出布鲁菌核酸的反应管出现荧光，未扩增出布鲁菌核酸的反应管无荧光出现(图4B)。

用该方法检测羊血液162份，检出布鲁菌14份，布鲁菌检出率为8.6%。

1.双蒸水；2.布鲁菌疫苗(M5株型)阳性DNA；3.大肠埃希菌DNA；4.绿脓杆菌DNA；5.沙门菌DNA

1.Double-distilled water；2.Brucella(M5)DNA; 3.E.coliDNA;4.P.aeruginosaDNA；5.SalmonellaDNA

图2 布鲁菌Omp25基因的实时浊度仪LAMP扩增结果

Fig.2 Amplification results ofBrucellaOmp25 gene by real-time LAMP

1.阳性对照；2.阴性对照；3、4.待检样品

1.Positive control; 2.Negative control; 3，4.Samples

图3 布鲁菌Omp25基因实时浊度仪 LAMP扩增结果

Fig.3 Amplification results ofBrucellaOmp25 gene by real-time LAMP

A.可见光;B.紫外灯;1.阳性对照；2.阴性对照；3、4.待检样品

2.4 布鲁菌IS711基因的PCR扩增结果

分析电泳结果可得布鲁菌病疫苗(M5株)阳性DNA(2号泳道)及待检样品(4号泳道)在800 bp和180 bp有条带，说明扩增出布鲁菌核酸。阴性样品(3号泳道)及待检样品(5号泳道)只在800 bp有条带，说明未扩增出布鲁菌核酸(图5) 。此结果符合SN/T1088-2010判定方法。

用普通PCR方法检测羊血液162份，检出布鲁菌10份，布鲁菌检出率为6.2%。

3 讨论

布鲁菌病给许多国家和地区的畜牧业带来巨大的经济损失，同时也给畜牧从业者带来严重危害[10]。随着现代分子生物学的发展，PCR 及核酸探针等检测基因水平的方法逐渐被人们开发利用，由于检测过程复杂且对实验室仪器设备要求苛刻，致使这些方法难以满足基层检测需要。而LAMP反应所用引物是针对目标DNA链上的6个区段设计4个不同的引物，比PCR反应针对2个区段设计2条引物显著提高了特异性，反应时所用的链置换型Bst DNA合成酶可在恒温(60℃～65℃)进行DNA扩增，这大大缩短了以往检测所需时间，并且LAMP反应不需复杂仪器设备，这些优点说明LAMP反应更适用于基层检测需要。

M.DNA 标准 DL 2 000；1.双蒸水；2.阳性对照；3.阴性对照；4、5.待检样品

M.DNA Marker DL 2 000；1.Double-distilled water；2.Negative control; 3.Positive control; 4，5.Samples

图5 布鲁菌PCR扩增结果

Fig.5 Amplification results ofBrucellaby PCR

在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，会产生大量焦磷酸镁白色沉淀。本次试验根据这一原理将LAMP反应在金属浴中进行，结果显示阳性对照反应管会出现白色浑浊现象且肉眼可见，这说明该方法能扩增出布鲁菌核酸，结果与原理保持一致。该方法过程操作简便，实验设备要求较低，结果判定清楚直接。同时这种LAMP反应开始至结果判读均不需要打开反应管，这避免了因形成气溶胶而导致的DNA污染及假阳性的产生[11]。该种LAMP法完全适合基层条件检测的优点是其他方法所不及的。

本研究选择的Omp25基因在布鲁菌属种间有很高的同源性，并且Omp25基因是布鲁菌重要的毒力基因，根据该基因设计的引物具有较强的特异性。本次试验同时使用了LAMP 实时浊度仪，该方法可对反应过程中产生的焦磷酸镁白色沉淀的混浊度进行实时监测，并以图示形式反映出目的基因是否扩增。反应结束后可观察通道的变化，若通道有蓝色柱状出现且底部显示为红色时说明扩增出目的基因，表示为阳性；反之为阴性。结果表明,LAMP 实时浊度仪可以直观的通过图示反映出目的基因扩增量的变化及结果，但由于浊度仪价格昂贵这就表明该种LAMP方法并不适合基层的工作条件。

LAMP反应出现的大量扩增产物在结合钙黄绿素染料的情况下，会出现肉眼可见的颜色变化[12]。根据这一原理，试验中也利用了荧光目视检测试剂盒进行检测。结果表明,在加入该检测试剂经LAMP反应后，反应液由橙红色变为绿色的为阳性，反应液无变色(仍为橙红色)为阴性；在紫外照射下观察阳性发生荧光，阴性未发生荧光。这种可视化的颜色变化使LAMP反应的结果判定更明显清晰，但有资料显示该反应在预设反应时间达到之后应停止反应，若将反应时间延长至1 h以上，可能会出现假阳性[13]，并且试剂盒价格高昂，且需要紫外照射装置这种特殊设备，由此可得该法不利于基层检测。

PCR方法是实验室核酸检测常用的方法，也是基层使用灵敏性最高的检测方法。本次试验通过3种不同条件下的LAMP反应与PCR结果的比对，得出3种不同条件下的LAMP检出布鲁菌阳性率均高于PCR方法。而这3种不同条件的LAMP检出布鲁菌阳性率相同，重复率相同。综上所述，经不同条件下的LAMP反应得出在金属浴中进行LAMP方法可行，而金属浴LAMP具有无需昂贵设备及试剂的优势更适合基层检测条件，建议推广。

本次调查共检测伊犁部分地区162只羊，检出布鲁菌阳性14只，布鲁菌病感染率为8.6%；用4种方法检测的结果表明，在金属浴中进行的LAMP反应，更适合在基层推广应用。

[1] 高彦辉，赵丽军，孙殿军，等．布鲁氏菌病防治基础研究现状与展望[J]．中国科学，2014，44(6)：628-635.

[2] 李秀梅，郭 恋，梁智选，等．布鲁菌环介导等温扩增检测试剂盒的研制[J]．动物医学进展,2014，35(7)：6-10.

[3] Zhang S Q，Tan B，Li P，et al．Comparison of conventional RT-PCR，reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification,and SYBR green I based real-time PT-PCR in the rapid detection of bovine viral diarrhea virus nucleotide in contaminated commercial bovine sera batches[J]．J Virol Methods，2014(207)：204-209．

[4] Jung J H，Oh S J,Kim Y T，et al．Combination of multiplex reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with an immunochromatographic strip for subtyping influenza A virus[J]． Analytica Chimica Acta，2015(853)：541-547．

[5] Scheel C M，Zhou Y，Theodoro R C，et al．Development of a loop-mediated isothermal amplification method for detection ofHistoplasmacapsulatumDNA in clinical samples [J]．J Clin Microbiol，2014，52(2)：483-488．

[6] Sharma K，Bansal R，Sharma A，et al．Loop-mediated isothermal amplification for rapid diagnosis of tubercular uveitis [J]．JAMA Ophthalmol，2014，132(6)：777-778.

[7] Keizerweerd A T，Chandra A，Grisham M P．Development of a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for the detection of sugarcane mosaic virus and sorghum mosaic virus in sugarcane [J]．Virol Methods，2015，212：23-29．

[8] Roche M L，Najih P J R，Paliouras M，et al．A rapid diagnostic method forE.coliserogroups responsible for gastro-intestinal diseases using loop-mediated isothermal amplification [J]．Aanl Methods，2015，7：287-295．

[9] 郭 恋，蒙晓雷，李秀梅，等．加环引物LAMP法快速检测布鲁氏杆菌方法的研究[J]．上海畜牧兽医通讯，2015(2)：2-4．

[11] 邹 峰，董 林，杨俊涛，等．肺癌住院患者医院感染的病原菌分布及耐药分析[J]．中国医药指南，2014，12(16)：79-88.

[12] 杨 粤，付博宇，张蕴哲，等．环介导等温扩增检测技术的应用与方法改进[J]．食品安全质量检测学报，2016，7(4)：1526-1530．

[13] 赵 娜，刘金霞，孙殿兴．环介导等温扩增技术在临床检测中的优势与展望[J]．中国病原生物学杂志，2016，11(4)：381-384．

Study on Applification of Rapid Detection Technology ofBrucellain Sheep

GE Ting1，LEI Cheng-hong1，WANG Zhen-bao2，BIAN Sai-sai1，FAN Xin-li1

(1．CollegeofVeterinaryMedicine，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi，Xinjiang，830052，China； 2.YiliEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Yining，Xinjiang，835000，China)

The study used four detection methods aimed to confirm methods for sheepBrucellarapid detection and applied to grass-roots unit in Yili,Xinjiang.Brucellain sheep blood were detected using Turbidity LAMP,Metal bath LAMP,Fluorescent Detection Reagent LAMP and PCR method.Then the four detection results were compared.162 sheep blood samples were used to detectBrucella,and the respective detection rates were 8.6%,8.6%,8.6%,6.2%.According to the results,LAMP were better than PCR method on sensitivity and specificity.Metal bath LAMP method was easy to operate without special equipment,and it is more applicable to grass-roots unit.

sheep;Brucella; loop-mediated isothermal nucleic acid technique; detection

2016-06-13

新疆农业大学研究生产学研项目(xjaucxy-yjs-20151014);国家级大学生创新项目(201610758015)

葛 婷(1989-)，女，新疆石河子人，硕士研究生，主要从事动物疫病防控研究。*通讯作者

S852.614

A

1007-5038(2017)01-0011-05