液相色谱-串联质谱法测定红花中非法染色物新品红、金胺O和苏丹红Ⅳ含量的研究

李婷婷，刘 莉，曾 桢，孔卫东，李 良,刘 芬，刘文剑

液相色谱-串联质谱法测定红花中非法染色物新品红、金胺O和苏丹红Ⅳ含量的研究

李婷婷1，刘 莉1，曾 桢1，孔卫东1，李 良2,刘 芬3，刘文剑2

目的 建立液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法同时测定红花中非法染色物新品红、金胺O和苏丹红Ⅳ的含量。方法 采用安捷伦EC-C18(2.1 mm ×50 mm，1.8 μm)色谱柱，流动相为20 mmol/L甲酸铵+0.1%甲酸(A)和乙腈(B)，梯度洗脱，流速为0.2 ml/min，柱温为 40 ℃，离子化方式为ESI，检测模式为MRM，选择离子对：(1)新品红m/z 330.3→223.2，m/z 330.3→300.2；(2)金胺O m/z 268.2→147.2，m/z 268.2→252.2；(3)苏丹红Ⅳ m/z 381.2→224.1，m/z 381.2→91.1。结果 该方法新品红、金胺O和苏丹红Ⅳ的线性范围分别为0.1086～271.50 ng/ml、0.1392～348.00 ng/ml和0.1352～338.00 ng/ml，回收率(n=6)分别为97.45%、96.44%和97.58%，RSD分别为0.70%、1.12%和0.89%，精密度、稳定性和重复性的RSD均小于3%。结论 该方法提取简单，测定方法定量准确，灵敏度高，适用于红花中非法染色物新品红、金胺O和苏丹红Ⅳ的含量测定。

LC-MS/MS；红花；新品红；金胺O；苏丹红Ⅳ

红花为菊科红花属植物红花的干燥花,是一种传统的活血化瘀类中药[1]，临床常用于预防和治疗冠心病、脑血栓等心脑血管疾病。近年来，由于红花应用广泛，但是来源有限，因此存在造假、掺假的情况， 严重影响了药品质量，并损害消费者健康[2-5]。笔者采用液质联用技术，对从中药材市场、医院、药店等流通环节收集的红花药材进行了掺伪染色检测方法的研究。通过查阅文献，摸索多种实验条件，最终确立了红花中非法染色物新品红、金胺O和苏丹红Ⅳ的检测方法。该方法简便，灵敏度高，具有创新性，可为红花的质量检查工作提供可靠的技术保障。

1 仪器与试药

Agilent 1290 G6460CMS/MS 三重四级杆液质联用仪(美国安捷伦公司)；AE-240电子天平，AEG220电子天平(日本岛津公司)；Millipore-Q Gradient 超纯水装置(美国Millipore公司)。新品红对照品(中国食品药品检定研究院，100%，111955-201301)，苏丹红Ⅳ对照品(中国食品药品检定研究院，100%，111950-201301)，金胺O对照品(中国食品药品检定研究院，100%，111950-201301)，甲酸铵(Agilent G1946-85021)；乙腈(Amethyst Chemicals L990O07)；水为Millipore装置制备的超纯水；其他试剂均为分析纯。药材：红花药材为市售样品，经成都市食品药品检验研究院中药室鉴定来源为红花CarthamiFlos。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱EC-C18(2.1 mm ×50 mm，1.8 μm) ；柱温40 ℃；流动相20 mmol/L甲酸铵+0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～5 min，60%A→40%A；5～8 min，40%A→5%A，保持4 min；12～13 min，5%A→60%A)，流速0.2 ml/min；进样量2 μl。

2.2 质谱条件 电喷雾离子源( ESI)，进行正离子扫描，检测方式为正离子多离子反应监测(MRM)，离子喷雾电压3500 V，干燥气温度 350 ℃，干燥气流速10 L/min，碰撞气为高纯氮气。(1)新品红m/z 330.3→223.2， 300.2，Dell 时间均为0.4 s，裂解电压215 V，碰撞能分别为36 eV和40 eV；(2)金胺O m/z 268.2→147.2， 252.2，Dell时间均为0.4 s，裂解电压155 V，碰撞能分别为30 eV和34 eV；(3)苏丹红Ⅳ m/z 381.2→224.1，381.2→91.1，Dell时间均为0.8 s，裂解电压120 V，碰撞能分别为20 eV和28 eV。

2.3 溶液的制备 对照品储备液的制备：精密称取对照品各5 mg，分别置100 ml容量瓶，加50%乙腈至刻度，摇匀，再精密量取各1 ml置100 ml容量瓶中，加50%乙腈至刻度，摇匀，作为储备液。供试品溶液的制备：取样品0.2 g，精密称定，精密加入70%乙醇20 ml，超声(功率250 W，频率25 kHz)20 min，放冷，称定，补失重，用0.22 μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.4 标准曲线的制备 精密量取混合对照储备液适量，用50%乙腈制成质量浓度分别为0.10、0.50、5.00、10.00、50.00、100.00、250.00 ng/ml的系列混合对照品溶液。在拟定的LC-MS/MS条件下测定，各化合物定量离子对的峰面积(Y)对各组分浓度(X)经回归处理，得标准曲线。结果表明，新品红、金胺O和苏丹红Ⅳ浓度分别在0.1086～271.50 ng/ml、0.1392～348.00 ng/ml和0.1352～338.00 ng/ml范围内线性关系良好。回归方程、相关系数见表1。图1、图2、图3分别为3种染色物的选择离子色谱图。

2.5 检出限和定量限的测定 根据3种染色物对照品在S/N=3时的浓度，计算出测定方法的检出限(LOD)；根据对照品在S/N=10时的浓度，计算出测定方法的检出限(LOQ)，结果见表1。

表1 新品红、金胺O及苏丹Ⅳ的线性定量系数及最低检测限

图1 新品红对照品化合物MRM监测

图2 金胺O对照品化合物MRM监测

图3 苏丹红Ⅳ对照品化合物MRM监测

2.6 精密度试验 取3种染色物质量浓度为100 ng/ml的混合对照品溶液在拟定的LC-MS/MS条件下连续测定6次，由定量离子对的峰面积计算精密度。新品红、金胺O和苏丹红Ⅳ的RSD(n=6)分别为1.1%、1.2%、1.8%，表明方法的精密度良好。

2.7 回收率和重复性试验 精密吸取3种染色物混合对照溶液，加入不含染色物的红花样品中，按样品溶液制备，按拟定的LC-MS/MS条件测定，结果见表2。

表2 新品红、金胺O及苏丹IV加样回收率实验结果

2.8 稳定性试验 取3种染色物质量浓度为100 ng/ml的混合对照溶液，分别在之后的0、3、6、12、18、24 h时测定，根据3种染色物定量离子对的峰面积计算精密度。新品红、金胺O和苏丹红Ⅳ的RSD(n=6)分别为1.5%、1.2%、1.9%，结果表明3种染色物的混合对照溶液在24 h内基本稳定。

利用建立的LC/MS-MS检测方法，对经上述方法处理的红花，按以上试验条件进行检测，测定峰面积，用外标法计算17批次红花中的新品红、金胺O和苏丹红Ⅳ的含量，有三批次红花检出金胺O，其中批号为20150009的红花含量为345.6 ng/g，批号为20150039的红花含量为706.3 ng/g，批号为20150047的红花含量为178.0 ng/g；新品红和苏丹红Ⅳ均未检出。

3 讨 论

在方法学建立过程中，笔者对色谱柱、流动相组成、质谱条件确立进行了系统全面的优化。结果表明：(1)采用安捷伦EC-C18(2.1 mm ×50 mm，1.8 μm)色谱柱分离效果和峰形最优；(2)流动相中加入浓度为20 mmol/L甲酸铵可提高色谱峰响应强度，梯度洗脱，流速为0.2 ml/min，可以得到较好的分离效果；(3)离子模式的确立，本方法测定的3种目标物均为红花药材中常用的染色剂，根据其性质和分子结果，在正离子扫描模式下灵敏度最高。选择ESI+为电离模式，对质谱条件进行优化，确定分子离子峰，在此基础上，选择出丰度最大的两个子离子作为定量和定性离子，确定最佳碰撞能量，以获得最大灵敏度。

根据检验结果，目前红花药材中确实存在非法染色问题。有3批次红花检出金胺O，存在染料染色，可见红花染色问题相当突出，且染料种类繁多，呈现多样化、复杂化趋势。目前中药材及饮片、制剂中非法染色物的检测多采用液相色谱法[6,7]，阳性样品经液质联用确认的方法。笔者建立的LC-MS/MS检测红花中3种非法染色物的方法，采用MRM模式，选择性强，灵敏度高，可用于药材中非法染色物的快速检测，保障用药安全。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].一部.北京：化学工业出版社，2015：151-152.

[2] 肖海龙,屠海云,王红青,等.反相高效液相色谱法快速测定食品中18种水溶性合成着色剂[J].中国卫生检验杂志，2011，21(2):264-266.

[3] 田 华，贾继民，阿布力米提.红花等三种中药中砷、汞、铅含量的分析研究[J].中国卫生检测杂志，2012,22(8):1746-1747.

[4] LUAN Jie,NI Yanna,DING Qing.Detection of dyed saffron adulteration products[J].Anhui Med Pharm J，2012,16(7):917-919.

[5] Hu Xiaowei.Qualitative and quantitative determination of illegally added acid orange II in Croci Stigma by UPLC[J].China Pharm,2011,20(14):40-41.

[6] 杨建龙,曲艳丽,徐彤彤，等.HPLC-MS/MS法测定风湿关节炎片中松香酸的含量[J].中国药房，2015，30(25)：3.

[7] JIANG Lei,MENG Xiangsong,JI Fengjuan.Detection of orangeII in nvbao capsule by HPLC-DAD method[J].Anhui Med Pharm J,2011,15:437-438.

(2016-09-20收稿 2016-11-10修回)

(责任编辑 岳建华)

Simultaneous determination of illegal dyes of New fuchsin,Auramine O and Sudan Ⅳ inCarthamiFlosby LC-MS/MS

LI Tingting1,LIU Li1,ZENG Zhen1,KONG Weidong1,LI Liang2，LIU Fen3, and LIU Wenjian2.

1.Department of Traditional Chinese Medicine, Chengdu Institute for Food and Drug Control, Chengdu 610045, China; 2. Medical Affairs Office, Hospital of Jiangxi Corps of Chinese Armed Police Force, Nanchang 330006, China; 3. College of Pharmacy, Nanchang University, Nanchang 330006, China

Objective To develop an LC-MS/MS method for simultaneous determination of illegal dyes of New fuchsin, Auramine O and Sudan ⅣinCarthamiFlos.Methods Using Agilent EC-C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)column, the mobile phase consisted of 20 mmol/L ammonium formate+0.1% methane acid-acetonitrile using gradient elution. The column temperature was 40 ℃, ionization mode was ESI, and detection mode was MRM. The ion pair selected was: ①New fuchsin m/z 330.3→223.2，m/z 330.3→300.2; ②Auramine O m/z 268.2→147.2，m/z 268.2→252.2; ③Sudan Ⅳ m/z 381.2→224.1，m/z 381.2→91.1.Results The linear range of New fuchsin, Auramine O and Sudan Ⅳ was 0.1086-271.50 ng/ml, 0.1392-348.00 ng/ml and 0.1352-338.00 ng/ml, respectively, the recoveries were 97.45%, 96.44% and 97.58%, respectively, and RSD was 0.70%,1.12% and 0.89%, respectively. RSD of precision, stability and repeatability was less than 3%.Conclusions This method of extraction is simple to use, accurate for determination and highly sensitive. This method can be applied to the determination of illegal dyes of New fuchsin, Auramine O and Sudan Ⅳ in Carthami Flos.

LC-MS/MS;CarthamiFlos; New fuchsin;Auramine O;Sudan Ⅳ

李婷婷，硕士，主管药师。

1.610045，成都市食品药品检验研究院中药室；2.330006 南昌，武警江西总队医院医务处；3.330006，南昌大学药学院

李 良，E-mail:liliang06f@sogou.com

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