PCV2-Cap蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达与鉴定

胡元春，吕凤霞

（1.新乡市动物疫病预防控制中心，河南新乡453000；2.河南牧翔动物药业有限公司）

PCV2-Cap蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达与鉴定

胡元春1，吕凤霞2

（1.新乡市动物疫病预防控制中心，河南新乡453000；2.河南牧翔动物药业有限公司）

pCold是一种新型载体，可以在大肠杆菌中高效表达可溶性的目的蛋白，将含有Cap蛋白基因的重组质粒pCold-ORF2转化大肠杆菌，可溶性表达Cap蛋白，通过SDS-PAGE和Western blot对融合蛋白进行鉴定，大量表达后，对其进行了纯化。

PCV2；大肠杆菌

猪圆环病毒2型（PCV2）是仔猪断奶后多系统衰竭综合征（PWMS）的病原。该病以发热、渐进性消瘦、呼吸困难和黄疸等症状为特征的慢性传染病，更为严重的是PCV2的感染可以造成免疫抑制，引起其他各种病原的继发感染，造成的间接损失难以估计。目前，PCV2已经成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一。

PCV2病毒包含两个主要开放式阅读框ORF1和ORF2，分别编码病毒复制酶相关蛋白（Rep）和病毒衣壳蛋白（Cap），其中Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白，具有型特异性，存在3个特有的抗原位点，是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因，也可作为PCV试验猪及自然感染猪血清学检测的标志。目前，国内外学者应用不同表达系统对Cap蛋白进行原核或真核表达［1］，研究其免疫特性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

BL21感受态细胞，重组质粒pCold-ORF2，种毒PCV BH株及PCV阴、阳血清。

1.2 阳性质粒转化大肠杆菌感受态细胞

将阳性质粒1 μl加入到制备的BL21感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min；在42℃水浴中作用90 s，迅速取出来放在冰中冷却3～5 min；加入800 μl LB培养基，摇匀，放置在37℃培养45 min；取40 μl菌液涂布于浓度为50 μg/ml氨苄抗性平板上，37℃过夜培养。

1.3 目的蛋白表达条件的优化及大量表达

挑取单个菌落至3 ml含50 μg/ml的氨苄LB培养基中振荡培养12 h；将含重组质粒的大肠杆菌加入4管LB培养基中，在37℃摇床振荡培养，测量细菌浓度达到OD0.4～0.5，放入低温（15～20℃）摇床中30 min；然后分别在1、2、3、4管中加入不同浓度的IPTG进行诱导培养，放置在低温摇床中振荡培养24 h；将菌液转移至灭菌离心管中离心4 min，弃去上清，用300 μl PBS吹打沉淀至悬浮，用超声波裂解仪分别裂解4 min；将裂解出的蛋白在4℃离心机中离心，吸取上清液至新的EP管中，剩余的沉淀用400 μl PBS悬起；分别取50 μl上清液以及对应的沉淀悬浮液，加入loading Buffer12.5 μl，100℃煮沸5 min，进行SDS-PAGE电泳分析鉴定。选择条带最粗的浓度作为最佳浓度。以最佳浓度的IPTG作为诱导浓度低温诱导表达，在16 h、20 h、24 h、28 h取样，每次50 μl菌液，加入loadingBuffer12.5 μ l，100℃煮沸5 min；上样进行SDS-PAGE电泳分析鉴定，根据条带的粗细确定最佳诱导时间。选取最佳诱导浓度的IPTG，在最佳诱导时间内进行目的蛋白的诱导表达。

1.4 阴性对照

将未连接目的基因的pCold载体转化大肠杆菌BL21感受态细胞，选取最佳诱导条件，进行大量表达。对表达出的菌液离心，弃去上清，沉淀用PBS重悬，超声裂解仪裂解菌体，裂解出的上清作为阴性对照进行SDS-PAGE电泳分析鉴定及Western blot。

1.5 可溶性重组蛋白的纯化

1.5.1 纯化柱的制备

加2 ml树脂于柱子中，静置待上清与沉淀分层，打开柱子底部和顶部的盖子，靠重力作用滤出上清；待上清完全滤出，加入6 ml的去离子水，重悬树脂，静置分层，滤出上清；加入6 ml 1×Native Purification Buffer，重悬树脂，静置分层，滤出上清，重复两遍。

1.5.2 纯化蛋白

将蛋白裂解液上清（可溶性蛋白）加入已制备好的柱子中，静置待上清与沉淀分层，打开盖子，滤出上清；用8 ml Native Wash Buffer重悬树脂，静置分层，滤出上清，重复3次；用8 ml Native Elution Buffer洗脱蛋白，收集上清。将诱导产物及纯化产物分别进行SDS-PAGE电泳分析鉴定及Western blot。

1.6 SDS-PAGE电泳

将配好的12%胶板固定于电泳装置，加入1×Running Buffer后加样。将阴性对照GST、诱导产物、纯化产物同时进行SDS-PAGE电泳（上层胶80～90V，下层胶120～130V），当指示剂迁移至底部时停止电泳，进行考马斯亮蓝染色，观察条带。

1.7 Western blot

将样品按上述方法进行SDS-PAGE电泳后，进行半干转印至硝酸纤维素膜（20V，30min），10%的脱脂乳37℃封闭3 h；加入用PBST稀释的单抗，过夜；PBST洗涤膜3次，每次10 min；加入1∶20 000 IgG-HRP，室温作用1 h，充分洗涤后，使用SuperSignal West Pico Trial Kit显色后进行X光显影，观察特异蛋白条带。

2 结果与分析

2.1 目的蛋白表达与条件优化

将不同浓度IPTG不同诱导时间的诱导表达产物经SDS-PAGE电泳后，结果显示pCold-ORF2转化大肠杆菌BL21诱导后在23kD附近出现蛋白条带，0.1mM的IPTG诱导效果最好，诱导表达24 h诱导量达到最高。

2.2 目的蛋白的纯化

将上清经亲和层析柱纯化后，纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析，可得到一条较纯的目的条带。同时将空载体蛋白作为阴性对照。

2.3 Western blot结果

将纯化前后的目的蛋白进行Western blot鉴定，经X光显影后，在胶片上均出现大小约为23kD的特异性目的条带，纯化后的蛋白条带单一，纯化效果较好。上述结果说明表达的可溶性蛋白具有良好的PCV2抗原性。

3 讨论

近年来，猪圆环病毒2型已成为兽医病毒学研究的热点之一。Cap蛋白是PCV2的主要免疫原［2］，在流行病学诊断及疫苗学研究中具有重要地位，因此该蛋白是PCV2的研究热点。国外已有利用表达的PCV2 ORF2编码的Cap蛋白作为抗原建立PCV2抗体检测ELISA的报道。

目前，对目的蛋白的表达主要是采用原核表达系统和真核表达系统。该研究使用的质粒pCold-ORF2中含有的PCV2 ORF2基因为羧基段部分基因，去除了N端的大量稀有密码子，可以在大肠杆菌中诱导表达。

该研究选用pCold载体与目的基因连接，转化大肠杆菌BL21进行蛋白的表达，极大提高可溶性蛋白的表达量。除此之外，降低重组蛋白合成的速率可以提高蛋白的可溶性，蛋白质动力学模型研究表明，活性蛋白的产率取决于蛋白合成的速率、蛋白折叠的速率、蛋白聚集的速率。在高水平表达时，新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白折叠的速率就会导致包涵体的形成。因此降低重组蛋白合成的速率可以提高蛋白的可溶性。在低温环境下，细菌生长缓慢，蛋白质合成也相应较慢，新合成的蛋白质会有更充分的时间折叠，同时降低培养温度也能降低重组蛋白降解的速率，提高重组蛋白的稳定性，但有一个下限为8～10℃，低于此温度，大肠杆菌会停止生长，蛋白液基本停止表达。所以该研究采用低温（15～20℃）进行诱导培养。

该研究将含有PCV2 ORF2基因为羧基段部分基因的重组质粒pCold-ORF2转化大肠杆菌BL21中，通过最佳诱导表达条件的优化，成功表达出了目的蛋白，获得一个大约23kD的重组蛋白，通过Western blot分析，表明此蛋白具有很好的免疫原性。为建立PCV2感染诊断与检测的血清学技术奠定了良好的物质基础。

［1］琚春梅，陈焕春，刘正肥，等.应用在大肠杆菌中表达的猪2型圆环病毒ORF2蛋白建立一种ELISA诊断方法［J］.畜牧兽医学报，2004，35（6）：689-693.

［2］刘长明，陆月华，张超范，等.猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的报道［J］.中国预防兽医学报，2005，27（6）：479-482.

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1004-5090（2017）04-0005-02

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