抗脂肪细胞膜蛋白抗体对试验性肥胖大鼠5种激素水平的影响

刘超英，胡忠梅，李卫真，张永云，赵素梅，代飞燕，彭 洁，俞大阔，和绍禹，周 明

(1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201；2.云南省昭通农业学校，云南昭通 657000；3.云南农业大学农科专业基础实验教学示范中心，云南昆明 650201；4.云南农业大学云南省动物营养与饲料重点实验室，云南昆明 650201；5.云南农业大学东方蜜蜂研究所，云南昆明 650201；6.昆明学院，云南昆明 650214)

抗脂肪细胞膜蛋白抗体对试验性肥胖大鼠5种激素水平的影响

刘超英1△，胡忠梅2△，李卫真1，张永云3，赵素梅4，代飞燕1，彭 洁1，俞大阔1，和绍禹5，周 明6*

(1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201；2.云南省昭通农业学校，云南昭通 657000；3.云南农业大学农科专业基础实验教学示范中心，云南昆明 650201；4.云南农业大学云南省动物营养与饲料重点实验室，云南昆明 650201；5.云南农业大学东方蜜蜂研究所，云南昆明 650201；6.昆明学院，云南昆明 650214)

为了验证抗脂肪细胞膜蛋白抗体减少动物脂肪沉积的作用效果，并对该抗体用于人类肥胖的治疗提供理论依据和试验资料，本试验分别对4组试验性肥胖大鼠注射0、0.1、0.5、1.0 mg/mL剂量的抗脂肪细胞膜蛋白抗体，并检测4周内大鼠血清中5种激素含量及变化。结果显示，试验组血清中胰岛素(INS)含量低于对照组，Ⅰ组与Ⅳ组4周内均差异显著(P<0.05)；试验组与对照组、胰岛素样生长因子1(IGF-1)含量无显著差异(P>0.05)；注射抗体后，试验组生长激素(GH)含量显著增高，且Ⅰ、Ⅲ组4周内均差异显著(P<0.05)；第1周内，试验组三碘甲状腺原氨酸(T3)含量与对照组无显著差异(P>0.05)，后3周内Ⅰ组和Ⅳ组差异显著(P<0.05)；第1、3、4周内，Ⅰ组和Ⅳ组四碘甲状腺原氨酸(T4)含量差异显著(P<0.05)，第2周内无显著差异，Ⅱ组和Ⅲ组差异均不显著(P>0.05)。此外，不同组间的差异显著性随注射剂量不同而不同。

抗脂肪细胞膜蛋白抗体；试验性肥胖大鼠；激素

动物体脂的沉积程度是衡量胴体组成的一个重要指标。由于养殖业的规模化和快速化，动物体脂过度沉积现象日益凸显，降低脂肪沉积量已成为亟待解决的问题之一[1]。有研究表明，脂肪细胞膜上存在许多类型的特异蛋白质，由于抗脂肪细胞膜蛋白抗体与被免疫动物脂肪细胞膜蛋白的高度特异性结合[2-3]，影响或阻碍激素与脂肪细胞膜上受体的结合。激素与受体结合的改变会产生一系列的生化变化，进而影响脂肪代谢。段纲等[4]通过对猪注射抗脂肪细胞特异膜蛋白单克隆抗体，研究了主要与代谢相关的胰岛素(insulin，INS)[5-6]、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)[7]、生长激素(growth hormone，GH)[8]、三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine，T3)和四碘甲状腺原氨酸(tetraiodothyronine，T4)的含量变化，为该抗体在动物生产领域的应用提供了理论依据。本试验对注射抗脂肪细胞膜蛋白抗体后的试验性大鼠血清中INS、IGF-1、GH、T3和T4等5种激素含量进行测定，不仅能够促进该抗体的生产应用，也可为进一步研究动物脂肪沉积问题奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 7周龄、体重大约200 g的健康SD大鼠60只，购自昆明医学院实验动物中心。

1.1.2 主要仪器设备和试剂 SN-682型放射免疫γ计数仪，上海福光仪器有限公司产品；ELISA试剂盒，天津九鼎医学生物工程有限公司产品；膜萃取液、磷酸缓冲液、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等试剂。

1.2 方法

1.2.1 试验性肥胖大鼠病理模型建立 肥胖动物的建模方法目前主要有高脂肪饲料诱导、下丘脑腹内侧核损伤、双侧卵巢切除法及大量维生素D诱导等多种肥胖动物病理模型的建模方法[8-9]，本研究选用高脂肪饲料诱导法。选择SD大鼠60只，雌雄比为1∶2。连续6周饲喂大鼠高能量饲料，饲料成分见表1。使大鼠增肥至体重约280 g后停止饲喂，成功建立试验性肥胖大鼠模型。

1.2.2 试验设计 将60只试验性肥胖大鼠随机分成Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组等4组，Ⅰ组为对照组，Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组为注射抗体试验组。

表1 饲料营养成分

1.2.3 抗体注射 抗脂肪细胞特异膜蛋白抗体由云南省动物营养与饲料重点实验室制备[10-11]。Ⅰ组注射1 mL生理盐水，Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组分别腹腔注射1 mL含有0.1、0.5、1.0 mg/mL抗脂肪膜蛋白抗体剂量的生理盐水。

1.2.4 血样采集 前期研究表明，该抗体经腹腔注射后4周内会完全降解。因此，注射抗体后，分别在第0、1、2、3、4周对大鼠进行眼眶采血，每只采血1 mL，2 500 r/min离心5 min分离血清，置-20 ℃冷冻保存备用。

1.2.5 激素含量的测定 试验采用竞争性放射免疫测定法测定INS含量，平衡饱和竞争性放射免疫分析法测定胰岛素样IGF-1含量，双抗体放射免疫法测定GH含量，液相平衡竞争性放射免疫分析法测定T3、T4含量。

1.2.6 数据处理 试验数据采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析，并进行多重比较。

2 结果

2.1 血清胰岛素含量

由图1可以知，注射抗体后1周内血清INS含量Ⅱ组、Ⅲ组有所上升，但低于对照组，Ⅳ组下降，与对照组相比差异显著(P<0.05)；第1周至第3周血清INS含量先下降后上升，试验组血清中INS含量低于对照组，第3周时差异显著(P<0.05)，各试验组间无显著差异(P>0.05)；第4周时，Ⅳ组低于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组且差异显著(P<0.05)。结果表明，抗脂肪细胞膜蛋白抗体可明显降低大鼠血清INS含量，注射不同剂量，降低大鼠血清INS含量的程度不同，其中，高剂量组效果最为明显。

图1 血清INS含量变化

2.2 血清胰岛素样生长因子1含量

由图2可知，试验组注射0.1、0.5、1.0 mg抗体后1周内试验组大鼠血清IGF-1含量有所上升，与对照组相比无显著差异(P>0.05)；1周后血清IGF-1含量均下降，第2周时下降到最低；第2周后试验组逐渐上升，对照组逐渐下降；第4周时试验组均高于对照组。4组IGF-1含量始终差异不显著(P>0.05)。因此，抗脂肪细胞膜蛋白抗体可在一定程度内提高大鼠血清IGF-1含量。

图2 血清IGF-1含量变化

2.3 血清生长激素含量

由图3可知，注射抗体后，试验组血清GH含量始终高于对照组。先逐渐升高达到最高水平，之后开始下降，后又上升趋于平稳。第1周Ⅰ组与Ⅱ组、Ⅲ组差异显著(P<0.05)，Ⅱ组与Ⅳ组间差异显著(P<0.05)；第2周Ⅱ组分别与Ⅰ组、Ⅲ组间差异不显著(P>0.05)，其余组间均差异显著；第3周时对照组低于试验组含量，Ⅰ组、Ⅱ组间差异不显著(P>0.05)；第4周时Ⅳ组血清GH含量高于其余3组，Ⅱ组分别与Ⅲ组、Ⅳ组间差异不显著(P>0.05)，其余组间均差异显著(P<0.05)。结果显示，抗脂肪细胞膜蛋白抗体可明显提高大鼠血清GH含量，根据注射的剂量不同，提高大鼠血清GH含量的程度不同，且组间有明显差异，高剂量组提高的幅度最大，效果最明显。

2.4 血清三碘甲状腺原氨酸含量

由图4可以知，注射抗体对照组血清T3含量逐渐降低，试验组趋于平稳。第1周时试验组血清T3含量略低于对照组，但无显著差异(P>0.05)，第2周到第4周，试验组高于对照组；第2周时Ⅳ组血清T3含量高于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组，且均差异显著(P<0.05)；第3周时Ⅰ组、Ⅲ组间，Ⅱ组、Ⅳ组间均差异不显著(P>0.05)，其余组间差异显著(P<0.05)；第4周时对照组显著低于各试验组(P<0.05)。由结果可知，抗脂肪细胞膜蛋白抗体可明显提高大鼠血清T3的含量，0.1 mg剂量的抗体激素水平升高最为明显。

图3 血清GH含量变化

图4 血清T3含量变化

2.5 血清四碘甲状腺原氨酸含量

由图5可知，注射抗体后对照组血清T4含量几乎无变化，试验组含量高于对照组且呈现升高降低再升高的趋势。第1周时Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组血清T4含量显著高于Ⅰ组(P<0.05)；第2周时Ⅲ组略高于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅳ组，各组间差异不显著(P>0.05)；第3周时Ⅰ组和Ⅳ组血清T4含量差异显著(P<0.05)，其余组间均不显著(P>0.05)；第4周时Ⅳ组血清T4含量显著高于Ⅰ组和Ⅱ组(P<0.05)。由结果可知，抗脂肪细胞膜蛋白抗体可明显提高大鼠血清T4含量，并随着注射剂量的增加而增加，高剂量组效果最为明显。

3 讨论

抗脂肪细胞膜蛋白抗体可与动物脂肪细胞膜蛋白高度特异性结合，从而影响脂肪代谢以及激素与脂肪细胞膜上受体的结合，如胰岛素受体、α肾上腺素受体等。激素与受体结合后，首先会使脂肪细胞腺苷酸环化酶(cAMP酶)发生变化，然后导致环腺苷酸(cAMP)浓度改变，进而使依赖cAMP的蛋白激酶活性发生改变，从而影响脂肪代谢。Flint D J等[12]首次提出用脂肪细胞膜蛋白制备抗体的设想并进行验证，结果发现注射抗脂肪细胞膜蛋白抗体的动物脂肪沉积显著减少，体重增加，饲料转化效率提高且无任何副作用[13]。随着对抗脂肪细胞膜蛋白抗体的深入研究，其应用领域有可能逐渐从动物扩展到人，为人类肥胖症的治疗提供新的思路。

图5 血清T4含量变化

INS是一种抗脂解激素，它一方面可以通过抑制脂肪酶的活化和促进脂肪酸再酯化而抑制脂肪组织释放脂肪酸；另一方面还可以通过加强葡萄糖-6-磷酸经糖代谢途径产生乙酰CoA和NADPH，从而增加脂肪酸的合成，还能促进α-磷酸甘油的生成和抑制脂酰CoA进入线粒体氧化，因而有利于脂肪的合成。另外，胰岛素可增加脂蛋白脂肪酶的合成从而增加脂肪的贮存[14]。所以胰岛素作用的削弱会使动物脂肪合成受阻，从而使脂肪沉积减少。GH是调节动物生长的一种蛋白质类激素，可促进脂肪分解和蛋白质合成，调节养分在各组织间的重新分配。GH可调控IGF-1的分泌及合成，IGF-1介导GH作用的发生，因此IGF-1的分泌水平能很好地反映GH水平。GH与IGF-1均呈脉冲式分泌，两者的分泌趋势相似，IGF-1可反映动物的生长及脂肪和蛋白质的代谢情况[15]。T3和T4可调节脂类、蛋白质代谢，加速脂解。T3还可抑制cAMP磷酸二酯酶，从而促进脂肪组织中腺苷酸环化酶的合成。T3能够促进脂肪组织中的脂肪分解，使血浆游离脂肪酸和甘油三酯的浓度增加，促进肝脏对胆固醇的降解。赵伟等[16-17]报道，抗脂肪细胞膜蛋白多克隆抗体免疫后2-8周血清胰岛素含量试验组低于对照组(P>0.05)，第4周后血清T3含量高于对照组(P>0.05)。本试验也取得了与此一致的结果。

注射抗脂肪细胞膜蛋白抗体后试验组与对照组相比，血清INS含量明显降低，血清IGF-1、T3、T4含量有所提高。本试验结果与段纲等[4]和李卫真等[18]研究结果一致。血清INS含量的降低表明大鼠脂肪合成受阻，同时血清GH、IGF-1、T3、T4水平提高可促进脂肪分解、蛋白质合成，减少体脂沉积，增加蛋白质沉积，调节养分在各组织间重新分配。抗脂肪细胞膜蛋白抗体对内分泌代谢的影响与注射剂量有关，注射剂量不同对内分泌代谢影响的程度不同，高剂量组的影响比较明显。

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Effects of Antibody against Adipocyte Membrane Protein on Five Kind of Hormone Levels in Experimental Obese Rats

LIU Chao-ying1,HU Zhong-mei2,LI Wei-zhen1,ZHANG Yong-yun3,ZHAO Su-mei4, DAI Fei-yan1,PENG Jie1,YU Da-kuo1,HE Shao-yu5,ZHOU Ming6

(1.FacultyofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan， 650201,China; 2.AgriculturalschoolofZhaotong,Zhaotong,Yunnan， 657000,China;3.TeachingDemonstrationCenteroftheBasicExperimentsofAgriculturalMajors,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan， 650201,China;4.YunnanKeyLaboratoryofAnimalNutritionandFeed，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming，Yunnan， 650201,China;5.EasternBeeResearchInstitute,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming，Yunnan， 650201,China;6.KunmingUniversity,Kunming，Yunnan， 650214,China)

To verify the effects of antibody against adipocyte membrane protein on animal fat deposition and provide the theoretical basis and experimental data for using the antibody to reduce human obesity,sixty experimental obese rats were injected with antibodies at 0,0.1,0.5,1.0 mg/mL respectively and the serum hormone contents were determinated every week.The results showed that the INS content in treatment groups was lower than that in the control group,but there was significant difference between Ⅰ group and Ⅳ groups(P<0.05).The content of IGF-1 showed no significant difference between treatment groups and control group (P>0.05).The GH contents in treatment groups increased significantly compared with the control group,and there was significant difference between Ⅰ group and Ⅲ group at 4 week (P<0.05).In the first week,the contents of T3in treatment groups had no significant difference with control group(P>0.05).But it showed significant difference between Ⅰand Ⅳ groups during the next 3 weeks(P<0.05).The T4contents in Ⅰand Ⅳ groups had significant difference at 1st,3rd and 4th week(P<0.05),and the Ⅱ group and Ⅲ group had similar tendency at 4 weeks(P>0.05).In conclusion,the hormones among different groups varied with the dose of antibody injected.

antibody against adipocyte membrane protein;experimental obese rat;hormone

2015-12-18

国家自然科学基金项目 (30260079)

刘超英(1992-)，女，河南安阳人，博士研究生，主要从事特种经济动物饲养研究。△同等贡献作者 *通讯作者

S856.5

A

1007-5038(2017)01-0061-04