中国部分地区对虾白斑综合征病毒胶原蛋白基因缺失变异分析

秦梦雪，刘庆慧，万晓媛，黄 捷,3

(1.农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛 266071；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；3.青岛海洋科学与技术国家实验室，海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东青岛 266071)

中国部分地区对虾白斑综合征病毒胶原蛋白基因缺失变异分析

秦梦雪1,2，刘庆慧1,3*，万晓媛1，黄 捷1,3

(1.农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛 266071；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；3.青岛海洋科学与技术国家实验室，海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东青岛 266071)

为了解我国主要对虾养殖区的白斑综合征病毒 (WSSV)胶原蛋白基因(wsv001)蛋白结构变异情况，以2015年13个省市发病地区采集的57份WSSV阳性样品为模板，用特异引物对目的片段进行扩增，连接转化扩增片段并进行测序分析。结果显示，57份WSSV阳性样品中，扩增出现条带的样品共有18份。氨基酸序列比对结果显示，扩增的wsv001片段所编码氨基酸出现三类变异，包括18个氨基酸小片段缺失，121个氨基酸大片段缺失及氨基酸插入，此外，还有8个氨基酸存在突变。结果表明，我国不同地区wsv001基因及其编码氨基酸存在明显缺失变异。对wsv001蛋白结构缺失变异的分析，为进一步对其蛋白功能和WSSV毒株毒力及WSSV对环境适应能力的研究提供参考。

白斑综合征病毒；胶原蛋白基因；缺失；变异；蛋白结构

对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是目前测序完成的最大的海洋无脊椎动物病毒。1997年，WSSV的病毒粒子从中国南美白对虾中分离得到[1]。WSSV的暴发严重影响着水产业的发展，它的致死力强[2-3]，一般健康对虾在感染3 d～7 d后，病死率高达90%～100%[4]。WSSV宿主范围广泛，可感染40余种甲壳纲动物及水生浮游动物[5]。WSSV是DNA双链病毒，包含305 107个碱基，181个开放阅读框(open reading frame,ORF)[6]。

对虾白斑病毒在形态学上与昆虫杆状病毒相似，但是这两种病毒在氨基酸水平上存在明显差异。相比于一些病毒基因，WSSV更象真核基因[7]。事实上，序列分析显示，WSSV不同于目前任何已知病毒。尽管少量基因与疱疹病毒有轻微的同源性，但大部分ORF所编码的蛋白质与已知的任何蛋白质不存在同源性。

WSSV最为特殊之处在于它自身存在一个完整的胶原蛋白基因(wsv001)。wsv001基因位于300501-445(ORF001)，编码1 684个氨基酸[8-9]，这一ORF所编码的产物显示与人类Ⅶ胶原蛋白存在同源性(已经确定42%超过1 336个氨基酸)，这是第一次在病毒中发现的一个完整的胶原蛋白基因。该胶原蛋白包含1个典型的重复单元Gly-X-Y(X是脯氨酸Y可以是任何氨基酸)，可以形成三螺旋状结构[10-11]。Li Q等[12]认为wsv001在WSSV感染机制中起到重要作用。同时Yang F等[8]认为这个胶原蛋白基因的存在可能有助于WSSV适应环境因素，或者有助于它们在对虾池塘中的长期生存。

目前,GenBank上公布的WSSV病毒株全序列共有4种，中国台湾株(TW,AF440570)(307 287 bp)、中国株(CN,AF332093)(305 107 bp)、韩国株(KR,JX515788)及泰国株(TH,AF369029)(292 967 bp)[13]。WSSV毒株间最大的差异往往表现在ORF14/15、ORF23/24、ORF75、ORF94、ORF125的变化，对2013年-2015年我国典型对虾养殖区WSSV阳性样品的分析显示,不同地区ORF14/15、ORF23/24、ORF75、ORF94、ORF125出现明显变异[14-15]，但wsv001基因及其编码的胶原蛋白是否变异尚不清楚。

本文针对WSSV不同毒株中wsv001基因的缺失突变情况进行研究，为其蛋白结构和功能分析及WSSV分子流行病学研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 本试验中所涉及到的样品是2015年WSSV暴发期间，采集于天津、山东、江苏、浙江、广东及海南6省(市)的病虾。病料采集后，由黄海水产研究所海水养殖生物疾病控制与分子病理学实验室在-80℃超低温冰箱保存。样品编号、产地、品种及目的片段PCR扩增情况见表1。DNA提取方法是将超低温冰箱中保存的样品解冻后，取鳃组织各30 mg，用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，提取各样品DNA，保存于-20℃冰箱备用。

表1 WSSV样本采集信息及wsv001扩增情况

续表1

序号№样品编号Sample№产地Site品种Species扩增结果Amplificationresults47jc150709038天津北辰BeichenTianjin凡纳滨对虾L．vannamei+48jc150709039天津北辰BeichenTianjin凡纳滨对虾L．vannamei+49jc150720001广东广州GuangzhouGuangdong凡纳滨对虾L．vannamei-50jc150710001天津宝坻BaodiTianjin凡纳滨对虾L．vannamei-51jc150820001山东潍坊WeifangShandong凡纳滨对虾L．vannamei-52jc150820003山东潍坊WeifangShandong凡纳滨对虾L．vannamei-53jc150820004山东潍坊WeifangShandong凡纳滨对虾L．vannamei-54jc150820005山东潍坊WeifangShandong凡纳滨对虾L．vannamei-55jc150820006山东潍坊WeifangShandong凡纳滨对虾L．vannamei-56jc150820007山东潍坊WeifangShandong凡纳滨对虾L．vannamei-57jc150820008山东潍坊WeifangShandong凡纳滨对虾L．vannamei+

注:“-”表示未扩增出，“+”表示扩增出。

Note:“-”represents not amplified，“+”represents amplified.

1.1.2 试剂 ExTaqDNA聚合酶、DNA标准(DNA Marker DL 2 000)，TaKaRa公司产品；T5载体，北京全式金生物技术有限公司产品；海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，天根生化科技(北京)有限公司产品；PCR产物纯化试剂盒，New England Biolabs(NEB)公司产品。

1.2 方法

1.2.1 PCR检测 将提取的WSSV DNA 样本按照GB/T 28630.2-2012 白斑综合征(White spot disease,WSD)诊断规程第 2 部分套式PCR 检测法进行检测。PCR产物通过TAE电泳缓冲液配制的10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳分析。

1.2.2 目的片段扩增 由于wsv001基因编码蛋白较大(1 684 aa)且结构复杂，选取第164到第401位氨基酸所对应核酸进行扩增(即该基因的第488 bp到第1 205 bp)。用引物01s2 5′-AAAGTAAGGAAATTACATGGCCCGA-3′和01a2 5′-TCCAGTCTCTCCTCTTGGGCCTTGT-3′进行PCR扩增。PCR扩增条件：94℃ 5 min;94℃ 30 s，59℃ 30 s， 72℃ 45 s，35个循环;72℃再延伸10 min。取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并将出现条带的产物用PCR产物纯化试剂盒进行产物纯化。

1.2.3 基因克隆与序列分析 将纯化好的PCR产物连接到T5载体中，借助卡那霉素进行筛选以及菌液PCR初步鉴定，将菌液送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测序结果借助软件DNA Man和NCBI网站进行比对分析。

2 结果

2.1 PCR检测结果

本试验中所涉及到的57份样品，通过PCR鉴定均呈WSSV阳性。

2.2 目的片段PCR扩增结果

57份样品中，PCR扩增出现条带的共计18份(9、13、14、15、16、17、18、32、33、34、35、36、37、45、46、47、48、57#)，检出率为31.58%。其中山东利津、江苏赣榆、天津汉沽、宝坻、海南海口及广东广州的样品未检出(图1)。

2.3 序列比对

将wsv001部分序列的扩增结果，与ORF2311(GenBank 登录号：AY048547)进行比对。结果显示，测序样品均出现不同程度的缺失或突变。将数据进行分析处理后发现，共存在三大类变异情况：①18 个氨基酸小片段缺失(图2)，出现在山东即墨、威海、昌邑及天津北辰的样品中，除18 个氨基酸缺失外，山东昌邑(16#)样品在309-373 aa缺失64个氨基酸，天津北辰(65#)样品在172-194 aa缺失22个氨基酸。将检测结果与原蛋白结构进行对比，显示此类缺失出现在选取片段的右数第2个胶原超家族结构(图3);②121 个氨基酸大片段缺失(图4)，出现在山东昌邑(15#、17#)、寿光(34#)和浙江舟山(33#)的样品中，对比其蛋白结构图发现，缺失片段导致选取片段的右数第2个胶原超家族结构消失(图5)，这种缺失所造成的蛋白功能上的改变尚不清楚；③比较罕见的变异情况，即氨基酸插入情况(图6)，在昌邑(13#)样品中检测发现，第253 aa后的20个氨基酸原序列中不存在，插入蛋白序列为-DGAVGPQGPPGERGENGRPGR-，蛋白结构分析显示，选取片段中的右数第2个胶原超家族结构发生变化(图7)。山东潍坊(57#)样品，第256 aa后多出GPA 3个氨基酸，比对结果未发现其对wsv001的蛋白整体结构产生影响。

此外，氨基酸序列对比发现存在8个氨基酸突变，其中山东即墨和昌邑样品中第288位谷氨酰胺突变为脯氨酸；山东昌邑、寿光、天津北辰和浙江舟山的样品中第364位谷氨酰胺突变为脯氨酸；山东昌邑及寿光样品中第366位精氨酸突变为谷氨酸；山东潍坊的样品中第377位精氨酸突变为赖氨酸，第314位丙氨酸突变为谷氨酰胺，第310、311位丙氨酸、缬氨酸突变为丝氨酸、异亮氨酸，第202位谷氨酰胺突变为脯氨酸(表2)。

A.样品编号1～22; B.样品编号23～44;C.样品编号45～57;M.DNA 标准 DL 2 000；+.阳性对照;-.阴性对照。

A.Number of samples 1-22; B:Number of samples 23-44; C.Number of samples 45-57; M.DNA Marker DL 2 000; +. Positive control;-. Negative control.

图1 目的片段PCR扩增结果

左右两边的矩形表示用引物扩增核酸编码的蛋白序列，中间的虚线表示缺失的部分，矩形两边的数字表示与wsv001对应的氨基酸位置

The right and left rectangles mean amino acids from sequences which can be amplified.The imaginary line in the middle means sequence deletion compared to wsv001.Figures on brackets indicate the originated and terminative positions corresponding to the wsv001

图2 18个氨基酸小片段缺失示意图

Fig.2 Deletion of 18 amino acids

图3 18个氨基酸小片段缺失蛋白结构图

左右两边的矩形表示用引物扩增出核酸编码的蛋白序列，中间的虚线表示缺失的部分，矩形两边的数字表示与wsv001对应的氨基酸位置

The right and left rectangles mean amino acids from sequences which can be amplified.The imaginary line in the middle means sequence deletion compared to wsv001.Figures on brackets indicate the originated and terminative positions corresponding to the wsv001

图4 121个氨基酸大片段缺失示意图

Fig.4 Deletion of 121 amino acids

图5 121个氨基酸大片段缺失蛋白结构图

左右两边的矩形表示用引物扩增出的蛋白序列，中间的虚线表示与选取片段蛋白序列进行缺失的部分，矩形两边的数字表示与wsv001对应的氨基酸位置

The right and left rectangles mean amino acids from sequences which can be amplified.The imaginary line in the middle means sequence deletion compared to wsv001.Figures on brackets indicate the originated and terminative positions corresponding to the wsv001

图6 氨基酸插入示意图

Fig.6 Insertion of amino acids

图7 氨基酸插入蛋白结构图

3 讨论

由于wsv001胶原蛋白基因较大(5 052 bp)，且基因缺失突变而致无法实现全长基因扩增。因此，本研究据其蛋白结构的复杂性，选择1个具有代表性的结构域，即wsv001氨基酸第164位到401位进行研究。选取片段扩增结果显示，有68.42%的样品未出现条带，可能由于样品不完整或存在该区域的普遍性变异。

据测序结果分析，3种缺失变异情况均对胶原蛋白超家族结构产生影响。WSSV作为一种包膜病毒，胶原蛋白基因在其侵染宿主过程中起着非常重要的作用。同时，wsv001作为病毒早期基因，同其他早期基因一样，当病毒染色体进入宿主细胞核后，随即开始转录表达，这对病毒的复制至关重要，且通常对宿主细胞有毒害作用，造成宿主快速死亡。此前，病毒类的胶原蛋白只发现了LCDV这一种，但分子质量较wsv001小很多[16]。高昀等[17]对wsv001部分片段的蛋白功能研究中发现，病毒对宿主肠和头胸甲优先入侵，并且胶原蛋白在行使功能的过程中存在自发降解可能。在胶原蛋白基因中，存在长度从几个到几十个氨基酸长度不等的非重复序列，一般将10个以上氨基酸组成的非重复序列称为中断区，是胶原蛋白空间结构形成的重要因素。故推测非重复序列的缺失或变异直接或间接造成胶原蛋白超家族结构发生改变，这种改变是否会影响WSSV的侵染过程尚不明确。

本文分析了WSSV中胶原蛋白基因的部分蛋白结构在不同地区的缺失突变情况。结果表明，wsv001编码氨基酸在第164到401位区域内，存在明显缺失突变情况，上述变异是否造成毒株的毒力差异和该胶原蛋白的功能改变，以及是否影响WSSV对环境的适应能力尚待进一步研究。

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Analysis of Collagen-like Protein Gene Deletion and Variation of WSSV in Shirmps from Different Parts of China

QIN Meng-xue1,2,LIU Qing-hui1,3,WAN Xiao-yuan1,HUANG Jie1,3

(1.KeyLaboratoryofSustainableDevelopmentofMarineFisheries,MinistryofAgriculture,YellowSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Qingdao,Shandong，266071，China; 2.CollegeFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai，201306，China; 3.FunctionLaboratoryforMarineFisheriesScienceandFoodProductionProcesses,QingdaoNationalLaboratoryforMarineScienceandTechnology,Qingdao，Shandong，266071，China)

To understand the white spot syndrome virus (WSSV) wsv001 protein structure variation in main shrimp culture regions of China, in this paper, the 57 WSSV-positive samples collected from 13 disease outbreak areas of China in 2015 were selected as templates. The products were obtained by PCR amplification with specific primer,and the amplified fragments were cloned and sequenced. Sequence aligment through cluster analysis showed that four samples had 18 amino acids deletion and three samples appeared 121 amino acids deletion. Furthermore, two samples showed 3 and 20 amino acids insertion, respectively. There is also 8 sites mutation of amino acids in some samples. All of the insertion or deletion mutations leaded to the structure change of collagen superfamily. In conclusion, wsv001 genes and their encoded amino acids had obvious deletion and variation in different areas of China. The results will benefit further study on the function of collagen protein, the virulence and environmental adaptation ability of WSSV.

White spot syndrome virus;collagen gene; deletion; variation; protein structure

2016-06-02

国家重点基础研究发展计划(2012CB114401)；农业部948项目(2016-X56)

秦梦雪(1990-)，女，河北唐山人，硕士研究生，主要从事分子生物学研究。*通讯作者

S917.4

A

1007-5038(2017)01-0021-07