纳葛胶囊对心肌缺血模型大鼠心肌组织NF-κB-P65和IκB-α基因表达的影响*

任凤梧 张树明 徐惠梅 曹 蕊 姚 琳 郭雪莹 马 迪 王伟明

（黑龙江省中医药科学院·哈尔滨 150036）

·方药研究·

纳葛胶囊对心肌缺血模型大鼠心肌组织NF-κB-P65和IκB-α基因表达的影响*

任凤梧 张树明 徐惠梅 曹 蕊 姚 琳 郭雪莹 马 迪 王伟明**

（黑龙江省中医药科学院·哈尔滨 150036）

目的：观察纳葛胶囊对Wistar大鼠心肌缺血模型中细胞内核转录因子-κB（NF-κB-P65）活性和人核因子κB抑制蛋白α(IκB-α)的RNA表达，从而研究该药对心肌缺血作用的可能机制。方法：健康Wistar大鼠90只，随机分为空白组、模型组、心通口服液阳性对照组及纳葛胶囊高、中、低剂量组。采用高脂饲料联合异丙肾上腺素注射法制备大鼠心肌缺血模型，运用聚合酶链反应技术检测大鼠心肌组织NF-κB-P65及IκB-α的基因表达。结果：纳葛胶囊高、中、低剂量组与各模型组及心通口服液组比较，NF-κB-P65基因表达显著降低，而IκB-α基因表达显著升高，差异均具有统计学意义（p＜0.05)。结论：纳葛胶囊可以通过降低NF-κB-P65的表达水平，并提高IκB-α的基因表达，调节内皮损伤介导的炎症反应，从而改善具有冠心病心肌缺血的作用。

冠心病 纳葛胶囊 聚合酶联反应 心肌缺血 NF-κB-P65 IκB-α

冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病（CHD），指冠状动脉粥样硬化使血管腔狭窄或阻塞，或（和）因冠状动脉功能性改变（痉挛）导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病，亦称作缺血性心脏病。近年来，随着生活方式的改变、社会的发展、社会压力的增加，社会心理因素对心血管疾病影响越来越大，尤其以冠心病多见。冠心病是心血管系统的常见病，其的发病率呈逐年上升的趋势，在我国属于高发病，且年龄趋向年轻化，已经严重威胁到人类的身心健康，因此冠心病的防治研究称为医学界的重要课题。

而细胞内核转录因子-κB（NF-κB-P65）和人核因子κB抑制蛋白α(IκB-α)在细胞因子诱导的基因表达中起关键性的调控作用，通过多种基因的表达，参与免疫反应、炎症反应等多种生物进程，在冠心病的发生发展中起重要作用。其中核因子κB，首先由Sen等在B淋巴细胞核抽提物中检测到[1-2]，后来现代分子生物学研究发现NF-κB存在于血管内皮细胞、血管平滑肌细胞及心肌细胞中[3]，并参与冠心病的发生发展和急性心肌缺血事件，与冠心病的关系得到日益广泛的重视。因此，通过观察缺血心肌中NF-κB-P65和IκB-α检测的PCR研究，进而探讨纳葛胶囊治疗冠心病的作用机制和疗效。

1 实验材料

1.1 实验药物

纳葛胶囊（原名：血畅胶囊），规格：0.3g/粒，主要由纳豆激酶、葛根、人参、三七、黄芪等组成；心通口服液，规格：10ml/支，鲁南厚普制药有限公司生产，批准文号：国药准字Z10920014。盐酸异丙肾上腺素注射液：上海禾丰制药有限公司生产，批准文号：国药准字H31021344，规格2ml/支。

1.2 实验动物

健康Wistar大鼠90只，雌雄各半，体重（180±20）克；由哈尔滨医科大学动物实验中心提供，实验动物许可证号：SCXK（黑）2013-001。

1.3 主要试剂

GOTaq 1-Step RT-qPCR System，南京佰杰斯生物技术有限公司

1.4 主要仪器

LDZX-75KB立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；NanoQuant infinite M200 PRO酶标仪，TECAN贸易有限公司；全自动凝胶成像分析系统，北京恒奥德仪器仪表有限公司；WH-2微型漩涡混合仪，上海沪西分析仪器厂有限公司；Sovall ST-16R离心机，赛默飞世尔科技公司；培养箱/干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；紫外分析仪，上海驰唐电子有限公司。

2 实验方法

2.1 大鼠心肌缺血模型制作及分组

采用高脂饲料喂养联合盐酸异丙肾上腺素腹腔注射法，建立大鼠冠心病模型[4]。健康Wistar大鼠90只，普通饲料喂养，自由饮水，适应性喂养1周。随机分为6组，每组15只，分别是正常组、模型组、心通口服液组及纳葛胶囊高、中、低剂量组。正常组给予普通饲料饲喂，其余组以高脂饲料饲（配方：胆固醇2%、猪油10%、甲基硫氧嘧啶0.2%、牛胆酸钠0.5%、基础饲料87.3%）饲喂4周，喂食量为25g（100g体重24小时），保证其充足的饲料和饮水。

2.2 各组给药方法

4周后开始灌胃给药，每日灌胃一次，按10ml/kg液体量灌胃，正常组及模型组给予蒸馏水灌胃；心通口服液组给予心通口服液灌胃（按2.7ml/kg给药，不足液体量应用蒸馏水补足）；纳葛胶囊各剂量组给予纳葛胶囊混悬液灌胃，纳葛胶囊高、中、低剂量组分别按0.648、0.342、0.171g/kg剂量配置相应浓度混悬液；各组均每天一次，连续灌胃4周。自末次给药前3d，除正常组外，其余各组皮下多点注射盐酸异丙肾上腺素（5mg/kg体质量），每日1次，连续3d，建立大鼠心肌缺血模型。末次注射后，各组动物分别以10%水合氯醛(0.3ml/100g体质量)腹腔注射麻醉，仰位固定，连接心电图机，记录末次注射异丙肾上腺素后5、10、20、30min的Ⅱ导联心电图（见附图1），观察ST段的改变，以大鼠心电图ST段抬高≥0.1mv作为造模成功的标志。

2.3 标本采集与处理

大鼠以10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，迅速打开胸腔，取出心脏至冰上，剪取大鼠心室部分心脏组织，用含0.1%DEPC的0.01mmolPBS溶液冲洗，放入4%多聚甲醛固定液中（含0.1%DEPC的0.01mmolPBS）固定4h，组织常规脱水，石蜡包埋，进行HE染色（见附图2-7）。其余心脏组织于冰上绞碎研磨并标记。

2.4 指标检测方法

采用聚合酶链反应（PCR）法[5]。用Trizol提取总RNA严格按说明书操作。建立25μL的扩增反应体系，依次加入下列试剂：cDNA1μL，ddH2O18.4μL，10×反转录缓冲液2.5μL，25mMgCl21.5μL，10mM dNTP混合物0.5μL，Taq酶0.5μL，目的基因及内参基因上下游引物各0.3μL，引物序列见表1。混匀后放入PCR仪，扩增条件如下：预变性94℃4min后进入PCR循环：变性94℃1min，退火37-65℃1min，延伸72℃1min，共30个循环后，终延伸72℃7min。PCR产物分析：RCR结束后，取6μLPCR产物于1.7%琼脂糖凝胶电泳，条带在凝胶成像分析系统下进行观察记录。电泳条件：60-80V，15-20分钟；紫外分析仪检查电泳结果。以GAPDH作内参照[6]，进行PCR产物的半定量分析。

2.5 统计学处理

所有数据用SPSS18.0统计软件分析，各组实验数据以(x±s)表示。采用独立样本间两两比较的秩和检验，检验中α取双尾为0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

各组大鼠心肌组织NF-κB-P65的表达水平结果显示，纳葛胶囊高、中低剂量组与模型组比较，基表达均降低：纳葛胶囊中、低剂量组与心通口服液组比较表达降低，低剂量级降低不明显。各组大鼠心肌组织IκB-α的表达水平结果，纳葛胶囊高、中、低剂量组与模型组比较，基表达均升高；纳葛胶囊中、低剂量组与心通口服液组比较表达明显升高，低剂量组不明显。

通过实验结果可以得出以下结论，与模型组及心通口服液组比较，纳葛胶囊各剂量组NF-κB-P65的表达均减低，IκB-α的表达升高(p＜0.05)，其中纳葛胶囊高剂量组及中剂量组降低明显，尤其以纳葛胶囊高剂量组降低最显著（p＜0.01)。纳葛胶囊可以有效抑制心肌组织中NF-κB-P65的表达，同时促进IκB-α的表达。

4 讨论

在我国古代医学文献中，并没有“冠心病”的病名，但是却有很多相关记载。根据本病的症状应属中医“胸痹”、“心痛”等范畴。《内经》名“心痛”，如《灵枢·五邪》称“邪在心，则病心痛”；《金匮要略》名“胸痹”，如胸痹首见于《金匮要略·胸痹心痛短气病脉证治第九》，在该篇中论述胸痹的病因病机为“阳微阴弦”，即胸阳不振，中下焦有痰饮水湿等阴邪上犯，痹阻胸阳,气血运行不畅，致胸痹的发生。其发生发展是多种致病因素相互作用的结果，进而导致脏腑功能失调、气血紊乱、痰淤阻滞。

心脏的缺血可引起心肌组织细胞因子的失衡及核转录因子的过度增多，导致心肌的炎症反应、坏死、凋亡等。这些病理改变与κB位点的基因过度表达有关[7]，提示NF-κB以及IκB参与了缺血再灌注损伤的生理病理过程，是心脏应激反应快速表达的基因蛋白产物，直接反应心肌和血管内皮细胞的损伤。

纳葛胶囊是黑龙江省中医药科学院根据长期的临床经验总结出的一个经验方，其主要成份为纳豆激酶、葛根、黄芪等中药，纳豆激酶具有溶解血栓、降低血液粘度、改善血液循环、软化和增加血管弹性[8]的作用；葛根有升阳解肌，舒经活络的功效；方中黄芪益气固表，全方严密配伍，治以补气活血，意在补气生血，正所谓“气行则血行”，具有益气而不破气，活血而不破血，通阳舒经而不纯补阳气的特点。该药率先把现代生物发酵技术与逆流连续提取技术相结合，快速溶栓、降脂[9]，达到溶栓不破血的目的。而现代中药药理研究证明，葛根具有降低心肌耗氧量，使冠脉血流量增加，缓解心绞痛、抗心肌缺血等作用[10],黄芪总皂苷对心血管疾病的作用主要有：强心、保护心肌细胞等[11]。中医药很好的弥补了西医治疗的不足，从根本上着手，有效的改善了患者的症状，提高了患者的生存质量，减少患者病死率，疗效确切，已经被普遍接受。

综上所述，本研究结果表明纳葛胶囊能够抑制NF-κB-P65和IκB-α的基因表达，从而抑制心肌血管，内皮的炎症反应，减慢了动脉粥样硬化的形成，具有抗冠心病心肌缺血的作用。

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[11] 沈自强.黄芪的现代药理研究进展[J].内蒙古中医药，2011,30（19）：117-117.

* 黑龙江省自然科学基金项目：H201459

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