H5亚型禽流感病毒的研究与应用

吴宗耀，张建超，彭禄庭，韩奇鹏

（1.湖南省浏阳市畜牧兽医水产局，湖南浏阳410300；2.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙410128）

H5亚型禽流感病毒的研究与应用

吴宗耀1，张建超1，彭禄庭1，韩奇鹏2

（1.湖南省浏阳市畜牧兽医水产局，湖南浏阳410300；2.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙410128）

禽流感病毒一直威胁着水禽养殖业、哺乳动物及人类健康。文章主要从H 5Nx亚型AIV流行现状、H 5亚型禽流感病毒检测方法、H5亚型AIV疫苗候选株的构建及鉴定和不同H5亚型AIV疫苗的研究与应用等方面进行阐述，为进研究H5Nx亚型AIV提供理论参考。

H 5亚型；禽流感；流感病毒；研究进展

引起禽流感爆发主要病原之一的H5N1亚型高致病性禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)，是造成家禽业经济损失最为严重的病毒。诱导哺乳动物和禽类产生免疫反应的主要两种抗原是神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)，它们都位于流感病毒颗粒表面的囊膜上[1]。预防AIV感染的主要措施有传统的重组活载体疫苗和全病毒灭活疫苗及新型具有更高安全性的病毒样颗粒 (Virus-like parricles，VLPs)等疫苗免疫[2]。

1 H5Nx亚型AIV流行现状

1.1 H 5N 2亚型AIV流行情况

Xu等[3]1996年在我国广东省水禽中首次发现H5N1亚型高致病性AIV。1997年在中国香港活禽市场和东南亚禽群爆发了高致病性H5N1流感病毒。2004年在台湾、日本、越南等首次报道感染H5N1。2004年东南亚地区累计已经有60个国家发现禽类中存在流行性H5N1流感病毒。2005年HPAIH5N1在中国西部青海湖区爆发水禽感染事件，致使大面积野禽死亡[4]。随着时间的推移，H5N1通过与H9N2、H6N6、H12N8及其他亚型流感病毒基因重组，生成其中毒株具有高致病性特征的新基因型的H5亚型AIV，如在全球流行很广的H5N2、H5N6、H5N8[5]。

1.2 H 5N 2亚型AIV流行情况

具有高低两种致病性的H5N2亚型AIV，低致病性一般存在野鸟中，在家禽中会变异成HPAIV[6]。由于H5N2与H5N1和H9N2亚型有AIV重组现象，所以H5N2亚型AIV与H5N1和H9N2的HA和NA基因相同。Zhao等[7]2012年发现重组的野生型H5N2亚型AIV(H5N1和H9N2)，是从中国西藏鸡群中分离出来的。H5N2亚型AIV重组后在家禽市场中发生持续性重组变异，并造成家禽养殖业巨大的经济损失。H5N2亚型AIV危害相比高致病性毒株低，主要对家禽影响体现在产蛋量下降、停蛋、受精困难、雏禽死亡率高及易感大肠杆菌等。

1.3 H5N 6亚型AIV流行情况

H5N6亚型AIV首次出现在我搞四川省南充，作为新型重组AIV，NA基因遗传于H6N6亚型AIV，还有部分基因遗传于H5N1亚型AIV[8]。H5N6亚型AIV分为江西系和四川系两种不同的分系，在江西和四川两省活禽市场分离出H5N6亚型AIV多的毒株有8株。家禽感染H5N6亚型AIV的后，肾脏、肺、心脏等器官出血，并发生明显的病理变化，对家禽和小鼠致病力和致死率都很高。今年，在我国黑龙江、广东、云南等省及越南、老挝等地分离出H5N6亚型AIV毒株。由于H5N6亚型AIV HA蛋白160位AA的T突变为A，且NA蛋白茎部缺失11个AA，进而使病毒与哺乳动物的亲和力增强[9]。我国感染人的H5N6亚型AIV同源与四川系。全球感染H5N6亚型AIV的人已有多例，但没有人传人的例证。

1.4 H 5N 8亚型AIV流行情况

2014年H5N8亚型AIV爆发于韩国[10]。随之台湾、日本、英国、荷兰、德国等发现H5N8亚型AIV病情，经济损失巨大。由于H5N8亚型AIV可能与候鸟迁移有关，所以疫情通常局部爆发，持续时间较短[11]。H5N8亚型AIV感染鸭子不会致死，感染其他家禽会致死，感染雪豹毒力很低，尚无感染人的病例[12]。

2 H5亚型禽流感病毒检测方法

血清众多、宿主范围广泛、抗原变异性强、感染频繁的禽流感病毒一直是养禽业的重大流行疫病[13]。H5高致病性的AIV不但对养禽业造成严重的经济损失，而且可直接感染人类。所以，快速检测H5亚型AIV，是养禽业正常发展和人类安全的重要保障。

2.1 实时定量RT-PCR技术快速检测

防控H5亚型AIV的重要措施是及时检测和快速诊断。实时定量RT-PCR(RRT-PCR)是检测AIV的方法其中之一。还有酶联免疫吸附试验(ELISA)，反转录 - 聚合酶链式反应（RT-PCR）,聚合酶链式反应(PCR)，免疫荧光试验(IFA)等。研究表明，实时荧光定量RT-PCR方法具有重复性好、灵敏度高、快速等特点，适用于快速定量检测H5亚型AIV[14]。传统检测方法的实验周期较长和仪器操作复杂等缺点，不能实现快速、准确诊断H5亚型AIV。

2.2 LAMP快速检测方法

水浴锅中等温条件下进行扩增反应的环介导恒等温扩增(LAMP)，恒温条件下完成了核酸变性和自动循环的链置换核酸扩增[15]。原理是等温条件下DNA聚合酶在几分钟内可大量扩增靶基因[16]。LAMP快速检测方法适用于基层诊断和筛查病原微生物（H5亚型AIV），具有操作简便、灵敏度高、特异性强、快速及肉眼观察结果和仪器设备便宜等特点。

2.3 RT-LAMP可视化检测技术

在LAMP快速检测方法的基础上建立一种可视化快速检测H5亚型AIV方法被叫做逆转录或反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)。此方法为控制疫情扩散和减少经济损失取得了宝贵时间。2013年[17]彭宜等优化RT-LAMP检测方法，使其操作更加简便快捷，采用常规水浴锅，恒温加热50min，便可特异性检测H5亚型AIV，灵敏的是常规RT-PCR的10倍，结果可根据反应液颜色变化进行判定，无需打开反应管盖。同样，实时荧光反转录环介导等温扩增(qRT-LAMP)可有效检测AIV-H5，灵敏度是国家标准实时荧光定量RT-PCR的100倍，最低可检测1个拷贝基因；该方法没有交叉反应，重复性较好，特异性较强；可应用于小规模AIV-H5的普查检测[18]。还有2016年[19]黄书林等针对H5亚型AIV血凝素(hemagglutinin，HA)基因的8个保守区域进行引物扩增。并在RT-LAMP反应体系中加入优选的冻干保护剂进行冷冻干燥。此方法比RT-PCR方法敏感10倍左右，并不影响等温扩增反应的敏感性。采用此方法可特异性检测传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)、新城疫病毒 (Newcastle disease virus,NDV)和禽流感病毒。此外，建立的H5亚型AIVRT-LAMP反应体系便于研制成试剂盒产品，其较高的灵敏性、特异性和简捷的操作利于养殖场和基层兽医实验室应用。

3 H5亚型AIV疫苗候选株的构建及鉴定

HA1和HA2构成的血凝素(hemagglutunin，HA)是AIV主要结构蛋白。HA1和HA2亚基的作用分别是识别细胞表面受体并与之结合，和参与病毒及细胞融合。作为AIV保护性抗原的HA，可通过细胞表面的 Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)来诱导产生中和抗体。一些TLR的配体是鞭毛蛋白，如TLR5。由四个结构域(D0、D1、D2、D3)组成的鞭毛蛋白，是细菌鞭毛表面丝状部位的结构蛋白。TLR5可识别高度保守的D1区，并产生大量的促炎细胞因子，今儿激发佐剂效应。研究显示，可增强鸡对禽流感疫苗粘膜免疫应答的沙门氏菌，说明鞭毛蛋白在家禽新型疫苗研制方面潜力很大[20]。还有学者正确构建出重组质粒pET32a-HA1-2-fijB,并成功表达出融合蛋白HA1-2-fijB，其具有良好免疫反应性和TLR5活性，为研制H5亚型AIV新型疫苗提供理论依据[21]。

2012年[22]张超林针对禽流感病毒颗粒(Avian Influenza Virus-like particles，AI-VLPs) 进行疫苗效力研究。得出AI-VLPs疫苗能诱导BALB/c小鼠和SPF鸡内的高水平HI抗体和中和抗体，且有效保护小鼠和鸡，免受致死性AIV的攻击。

2014年[23]王萱等针对不断变异的Clade2.3.4 H5亚型AIV潜在引发地方性流行性传播，根据流行检测抗原分析结果制备疫苗候选株。采用反向遗传操作系统，骨架为A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)AIV的内部基因，供体为Clade2.3.4 H5N1亚型AIV/chicken/Hebei/2/2011(wt-HB株)的NA和HA基因，把wt-HB株HA基因中编码多碱性氨基酸序列删除，得出1株重组病毒rHB/PR8。病毒rHB/PR8对鸡胚和鸡无致病性，但可在鸡胚和MDCK细胞上生长繁殖。上述研究为Clade2.3.4H5亚型AIV的变异防空提供了疫苗候选株。

2016年[24]吴艳涛在HVTFC 126疫苗毒株基因组US2区选择一个合适的位点进行插入，拯救了一株重组病毒rHVT-EGFP，其具有能够稳定表达绿色荧光蛋白(EGFP)。其次，根据同源重组原理，利用基因组与转运载体共然的方法，再用HA基因表达盒替换重组的病毒基因中的EGFP，成功拯救出rHVT-HA-R6、rHVT-HA-R7、rHVT-HA-R8 三 株表达HA基因的重组病毒，且三株重组病毒本省生物学特性未受到插入外源基因的影响。在此基础上，针对三株重组病毒的免疫效力进行了评价，得出HA抗原性相一致的H5亚型AIV能被重组病毒进行全面保护。

4 不同H5亚型AIV疫苗的研究与应用

禽流感病毒变异快，血清类型较多，导致防控很困难。到目前为止，没有防治禽流感的特效方法，主要的预防措施是接种疫苗，来阻止AIV的发生与传播[25]。

现在H5亚型AIV疫苗的类型有灭活疫苗(inactivated vaccine)、亚单位疫苗(subunit vaccine)、重组活载体疫苗 (Recombinant Live Influenza Virus Vaccine)、DNA疫苗及杆状病毒表达系统等。国内常用的一般是灭活疫苗和重组活载体疫苗。

4.1 灭活疫苗

禽流感全病毒灭活疫苗是在鸡胚囊腔上接种病毒株，待其增殖后，用甲醛灭活后得到。IV的优点是免疫效果较好、安全稳定、免疫持续期长及不出现毒力返强等。但免疫计量大、多次免疫，且不能诱导粘膜免疫和细胞免疫应答[26]。

有研究表明，H5亚型AIV的Re-4+Re-5株灭活疫苗加强免疫后，可让鸡群达到100%免疫，但鸭群免疫效果不明显[27]。而单独H5亚型AIV的灭活疫苗种毒Re-4免疫合格数为90%左右[28]。还有H5亚型AIV灭活疫苗种毒Re-6株具有抗原针对性强、鸡胚上可大量增殖，但对SPF鸡及其鸡胚没有致病性[29]。有专家以肉鹅作为研究对象，进行H5亚型AIV灭活疫苗对比试验，结果发现，水禽用H5亚型AIV灭活疫苗(H5N2亚型D7)和H5N1 Re-6株对肉鹅都有很好的免疫保护效果[30]。此外，H5亚型AIV灭活疫苗(H5N2亚型D7)对21d的SPF鸭HI抗体效价几何滴度可达7.4log2，且较好的免疫保护集体受到高致病性禽流感病毒的攻击,且可阻止机体排毒[31]。

4.2 重组活载体疫苗

重组活载体疫苗是一种重组病毒，是将免疫原性基因导入病毒载体中得到，免疫原性蛋白在动物体内不断表达，诱导动物机体产生免疫力。此疫苗的优点是安全性高、免疫效果好，但外源基因选择较难。具有较好免疫保护效果的重组禽痘病毒(fowl pox virus,FPV)表达了H5N1亚型HA和NA基因。将AIV HA基因插入新城疫的LaSota弱毒株中的禽流感-新城疫二联活疫苗，同时达到了预防禽流感和新城疫的效果。

有研究显示，禽流感-新城疫二联活疫苗(rLH5-1)诱导的HI抗体水平为5.13log2，且有补充作用新型基因工程疫苗具有较好的免疫保护性[32]。但有研究显示，禽流感-新城疫二联活疫苗(H5N1亚型，Re-6株+Re-4株)对商品肉鸡没有较好的免疫效果，所以需要实施生物安全措施[33]。

5 小结

在水禽养殖过程中，如何有效防控禽流感病毒其中重要环节之一。因为禽流感病毒不但影响水禽健康发展和经济效益，而且威胁到哺乳动物及人类健康安全。随着实际生产过程中禽流感病毒不断变异成新型病毒，对水禽养殖业疫苗防控和健康安全等方面提出新的要求与挑战，如何科学合理的快速、有效防控水禽养殖业禽流感病毒一直是人类关注的热点问题。

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S858.31

A

1006-4907（2017）04-0046-04

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.04.022

2017-06-30

吴宗耀（1977～），男，助理兽医师，大学本科，主要从事动物疾病监测工作，E-mail：2604454625@qq.com。