囊泡膜核苷酸转运体在核苷酸囊泡转运机制的研究进展

陈立强，王洋洋，司艳辉，梁洁玲，李海珠

(肇庆市第一人民医院，广东 肇庆 526060)

核苷酸在细胞内的运输不能自由穿过细胞膜，其储存与运输必须以囊泡运输的方式进行跨膜转运，当囊泡与胞膜融合时将核苷酸等内容物质释放到细胞外[1]。要探讨细胞外核苷酸/核苷激发的信号通路，就必须要理解三磷酸腺苷(ATP)和其他核酸是如何从细胞内释放出来的，而这也是生理学上的一个重要问题[2]；自从囊泡膜核苷酸转运体(vesicular nucleotide transporter，VNUT)被发现，其就作为ATP转运的关键因子而被广泛关注[3]；现将VNUT在核苷酸囊泡转运机制的研究最新进展进行综述。

1 VNUT

神经内分泌信号的传达需要大量不同种类的囊泡储存信号分子参与和调节。这些非肽类复合物的储存和转运都必须通过特定的囊泡转运蛋白进行运输，所有这些转运蛋白都属于溶质载体蛋白家族(solute carrier family，SLC)[4]。研究表明囊泡转运体内包含多种神经递质而每种神经递质都需要特定的囊泡转运体进行转运，而且囊泡里面还包含ATP和大量不同种类的核苷酸，囊泡内各种生物成分的相互作用，共同完成信号的激发和传播。囊泡一旦释放，囊泡内储存的ATP和核苷酸分子会与囊泡分泌细胞或者相邻细胞表面的特定P2X离子通道性受体或者P2Y代谢型受体相结合并产生生物学效应[5]。

VNUT属于solute carrier family 17 member 9(SLC17A9)，其定位于不同的ATP贮存器的囊泡膜上(如嗜铬颗粒和突触囊泡等)。VNUT通过由液泡膜质子泵产生囊泡膜电位差，形成的作用力从而主动运输ATP。VNUT特点是包括：(1)VNUT在转运囊泡中大量存在；(2)VNUT的抑制剂可使ATP的转运受到严重影响；(3)利用小干扰RNA对VNUT进行基因敲除可减少细胞ATP的分泌[6]；VNUT是由430个氨基酸残基组成的蛋白质分子，该蛋白分子有12个跨膜区间并且蛋白N和C末端都定位在细胞内。对VNUT进行荧光标识定位发现其与突触结合蛋白之间均存在于囊泡膜的相同位置，显示两种蛋白在囊泡转运中可能相互连接并共同完成囊泡转运和释放过程。通过小干扰RNA技术对VNUT蛋白进行敲除，可明显减少KCl诱导的ATP的分泌反应[7]。运用分子检测技术对VNUT蛋白的深入研究，发现VNUT在胃、肠道、肝脏、肺部、骨骼肌、甲状腺、脾、血细胞、上皮细胞和角化细胞中均有表达，显示VNUT调节活性分子进入分泌囊泡的生物反应不仅仅存在于脑组织和神经内分泌组织中，故VNUT在许多细胞和组织包装ATP进入分泌囊泡和释放过程中发挥着关键作用[8]。

2 核苷酸转运机制

人类基因组至少有19种含有嘌呤受体的核苷酸/核苷激活细胞存在，一旦嘌呤受体激活，可激活受体下游信号通路而引起一系列机体的生理反应。嘌呤受体包括三个亚型，分别是(1)ATP门控离子通道P2X受体；(2)G蛋白偶联P2Y受体，该受体可与ATP、ADP、UTP、UDP和糖化UDP相结合；(3)G蛋白偶联腺苷酸受体；该类受体在ATP的催化、转换和合成ADP、UDP和腺苷酸的过程中发挥着关键作用[9]。ATP、神经递质和其他活性分子在神经内分泌组织和细胞中是以囊泡形式进行储存和释放的，包囊物质通过电化学电位梯度(Δψ)和囊泡膜镶嵌的V-type H+-ATPase (V/H+-ATPase) 提供pH梯度产生的作用力进行转运。例如交感节前神经元嗜铬细胞在依赖钙离子的情况下利用梯度作用力将囊泡转运至胞膜，当细胞接收到释放信号，囊泡会与胞膜融合而释放囊泡内的信号物质到细胞外[10]。另外，研究显示ATP的囊泡释放过程存在于许多细胞，例如胰腺腺泡细胞、杯状细胞、肥大细胞、胰腺β细胞和其他外分泌或内分泌组织。囊泡的分泌过程需要有可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(soluble N-ethyl maleimidesensitive factor attachment protein receptor，SNARE)受体蛋白家族共同完成的，v-SNARE和t-SNARE受体家族会相互协调共同完成囊泡的转运、定位连接和融合[11]。SNARE的主要组成包括t-SNAREs突触融合蛋白、SNAP-25和v-SNARE突触囊泡蛋白(v-SNARE synaptobrevin，VAMP)。突触融合复合物的初始形成由突触融合蛋白、SNAP-25和突触囊泡蛋白；此外还需要其他蛋白的共同参与，包括Rabs和Muncs等蛋白，这些蛋白复合体共同形成SNARE的构成[12]。在神经递质释放的后期，突触融合蛋白/SNAP 25复合体会与突触囊泡蛋白结合，在依赖Ca2+的情况下，激发突触囊泡蛋白向细胞膜转移且与胞膜融合，囊泡膜融合并释放神经递质[13]。转运蛋白转移胞质的ATP进入分泌囊泡和通过囊泡和胞质的融合将囊泡内容物分泌到细胞外。

3 VNUT参与核苷酸囊泡转运

组织和细胞在ATP的分泌过程中VNUT充当着重要角色存在，例如T细胞受体(T cell receptors，TCR)被激活可导致淋巴细胞快速并大量分泌ATP，ATP的大量释放可激活P2X受体诱导的生理反应，如细胞增殖等[14]。通过利用巴佛洛霉素A1对囊泡转运和释放进行抑制，可发现TCR在依赖Ca2+的情况下诱导T淋巴细胞分泌ATP的机制受到严重影响；另外对VNUT基因进行敲除，可发现TCR诱导T淋巴细胞分泌ATP会明显下降。大量研究表明，VNUT在不同组织中对ATP转运和分泌均起到关键作用，例如在星形胶质细胞、肝细胞、肺泡上皮细胞A549和肠系膜上皮细胞、成骨细胞和食管角质形成细胞等都有相关研究报道[15]；通过利用这些ATP存量丰富的细胞系的试验，更能体现ATP的储存和释放过程VNUT扮演的角色和价值。

在许多细胞中，ATP不通过囊泡运输进行释放，而且巴佛洛霉素A1对这类细胞ATP释放的抑制作用不明显；而利用阻碍囊泡转运和融合的囊泡抑制剂对细胞进行作用，发现该类抑制剂对细胞ATP的释放亦不产生影响[16]。多药耐药基因(multidrug resistance，MDR-1)蛋白，Cl-跨膜电导调节器(CF transmembrane conductance regulator，CFTR)，线粒体电压依赖性阴离子通道-1( mitochondrial voltage-dep -endent anion channel-1，VDAC -1)被认为是激发ATP释放的通路或者促进了ATP的释放，对这类蛋白的深入研究有利于了解ATP释放信号激发和传导过程，为准确描述ATP信号通路提供有价值的素材。研究表明ATP的转运与释放与两种质膜通道相关，一是Cl-离子通道，例如maxi阴离子通道电压门控通道等；二是孔型连接蛋白、泛连接蛋白Pannexins家族和 P2X7受体等[17]。在胰腺腺泡细胞中，ATP与胰腺消化酶共同储存于囊泡细胞，在受到释放信号的刺激下，ATP与胰腺酶原颗粒(zymogen granules，ZG)一起释放到腺泡细胞外；而在ATP转运到ZG的分子动力学和药理学特性的研究中表明ATP必须VNUT的参与与调节。例如，ATP的囊泡转运会被巴佛洛霉素A1抑制和通过Cl-诱导激发，同时表现出KM通道和pH通道的依赖性，这些分子特性都与VNUT的生理特性一致，而且通过Western blot实验显示在分离的ZG中，VNUT表现出很强的免疫反应性[18]。

研究表明有许多蛋白参与ATP传导通道，包括Panx 1和连接蛋白(connexins，Cx)可协助ATP和UDP从胞质转运到细胞外；VNUT负责将ATP转运到储存囊泡内，在Ca2+通道激发状态下协助分泌囊泡与薄膜融合并释放ATP。UDP-葡萄糖(UDPG)和ATP可通过位于内质网/高尔基体的类似于SLC-35转运体的协助下，分别利用UMP和AMP作为逆向转运体的底物而逆向转运到分泌通路中。内质网/高尔基体核苷酸进行糖基化反应并产生能量驱动作用，该驱动作用力为囊泡运输提供能量来源，而内质网/高尔基体的代谢分子也能通过囊泡分泌旁路伴随核苷酸共同分泌到胞质中或者细胞外[19]。利用基因敲除技术对VNUT基因进行敲除，发现ATP的囊泡储存与释放受到了严重影响，ATP胞外释放的量严重减少，从而认证了VNUT在ATP转运到囊泡和囊泡ATP的胞外释放过程中均发挥着关键作用[20]。

4 小结

VNUT参与核苷酸囊泡转运过程且发挥着关键作用，其作用一是在核苷酸的囊泡内转运储存，为囊泡的细胞内运输提供能量支持；其二是ATP等高能分子的释放可激活一系列的细胞信号通路，导致细胞产生相应的生物学效应[21]。对VNUT蛋白及其调控因素的深入研究，有利于更加深入了解VNUT蛋白在囊泡运输未知的相关机制，从而为揭示囊泡运输过程提供更为可靠的科学依据。

[1] BURNSTOCK G.Purinergic signalling in endocrine organs[J].Purinergic Signal，2014，10(1):189-231.

[2] HARADA Y,HIASA M.Immunological identification of vesicular nucleotide transporter in intestinal L cells[J].Biol Pharm Bull,2014,37(7):1090-1095.

[3] GEISLER J C,CORBIN K L,LI Q,etal.Vesicular nucleotide transporter-mediated ATP release regulates insulin secretion[J].Endocrinology,2013,154(2):675-684.

[4] HAANES K A,KOWAL J M,ARPINO G,etal.Role of vesicular nucleotide transporter VNUT (SLC17A9) in release of ATP from AR42J cells and mouse pancreatic acinar cells[J].Purinergic Signal,2014,10(3):431-440.

[5] BURNSTOCK G,NOVAK I.Purinergic signalling and diabetes[J].Purinergic Signal,2013,9(3):307-324.

[6] VAN LIEFFERINGE J,MASSIE A,PORTELLI J,etal.Are vesicular neurotransmitter transporters potential treatment targets for temporal lobe epilepsy[J].Front Cell Neurosci,2013,30(7):13-24.

[7] Shinozaki Y,Nomura M,Iwatsuki K,etal.Microglia trigger astrocyte-mediated neuroprotection via purinergic gliotransmission[J].Sci Rep,2014,10(4):4329.

[8] HO T,JOBLING A I,GREFERATH U,etal.Vesicular expression and release of ATP from dopaminergic neurons of the mouse retina and midbrain [J].Front Cell Neurosci,2015,6(9):389-404.

[9] SUCKOW A T,ZHANG C,EGODAGE S,etal.Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic βcell function[J].J Biol Chem,2012,287(24):19816-19826.

[10] KATO Y,OMOTE H,MIYAJI T,etal.Inhibitors of ATP release inhibit vesicular nucleotide transporter[J].Biol Pharm Bull,2013,36(11):1688-1691.

[11] HWANG SL1,KWON O,KIM S G,etal.B-cell translocation gene 2 positively regulates GLP-1-stimulated insulin secretion via induction of PDX-1 in pancreatic β-cells[J].Exp Mol Med,2013,24(45):e25.

[12] LAZAROWSKI E R.Vesicular and conductive mechanisms of nucleotide release[J].Purinergic Signal,2012,8(3):359-373.

[13] MENÉNDEZ-MÉNDEZ A,DAZ-HERNNDEZ J I,MIRAS-PORTUGAL M T.The vesicular nucleotide transporter (VNUT) is involved in the extracellular ATP effect on neuronal differentiation[J].Purinergic Signal,2015,11(2):239-249.

[14] KOWAL J M,HAANES K A,CHRISTENSEN N M,etal.Bile acid effects are mediated by ATP release and purinergic signalling in exocrine pancreatic cells[J].Cell Commun Signal,2015,9(13):28-44.

[15] LARSSON M,SAWADA K,MORLAND C,etal.Functional and anatomical identification of a vesicular transporter mediating neuronal ATP release [J].Cereb Cortex,2012,22(5):1203-1214.

[16] PARPURA V,BAKER BJ,JERAS M,etal.Regulated exocytosis in astrocytic signal integration[J].Neurochem Int,2010,57(4):451-459.

[17] SAKAKI H,TSUKIMOTO M,HARADA H,etal.Autocrine regulation of macrophage activation via exocytosis of ATP and activation of P2Y11 receptor[J].PLoS One,2013,8(4):8.

[18] HIASA M,TOGAWA N,MIYAJI T,etal.Essential role of vesicular nucleotide transporter in vesicular storage and release of nucleotides in platelets[J].Physiol Rep,2014,2(6):34.

[19] SAUNDERS N R,DZIEGIELEWSKA K M,MØLLGRD K,etal.Influx mechanisms in the embryonic and adult rat choroid plexus: a transcriptome study[J].Front Neurosci,2015,12(9):123-144.

[20] TAKAI E,TSUKIMOTO M,HARADA H,etal.Autocrine regulation of TGF-β1-induced cell migration by exocytosis of ATP and activation of P2 receptors in human lung cancer cells[J].J Cell Sci,2012,125(21):5051-5060.

[21] WOLF-JOHNSTON A S,HANNA-MITCHELL A T,BUFFINGTON C A,etal.Alterations in the non-neuronal acetylcholine synthesis and release machinery in esophageal epithelium[J].Life Sci,2012,91(21-22):1065-1079.