3D打印技术在细胞打印方面的应用与发展

魏玉雪，刘晓秋，李迪，吕珊珊，魏珍

(吉林大学口腔医学院修复科1、黏膜科2、牙体牙髓病科3，吉林 长春 130021)

3D打印技术在细胞打印方面的应用与发展

魏玉雪1，刘晓秋1，李迪1，吕珊珊2，魏珍3

(吉林大学口腔医学院修复科1、黏膜科2、牙体牙髓病科3，吉林 长春 130021)

3D打印技术是一种快速成型技术。本文对3D打印的概念、发展、现状作了简要的概括，重点介绍了3D打印技术在细胞打印方面的应用，分析了各种细胞打印技术的原理及其优缺点，并对3D细胞打印的发展趋势进行了展望。

3D打印；生物打印；组织工程；细胞打印

从1986年3D打印技术问世以来，应用领域逐步扩展，包括生活用品、航空航天、机械制造、建筑工业造型和医学等领域甚至是活体器官[1]，而它在生物医学领域的应用则是当前研究的最前沿领域。美国克莱姆森大学的Thomas Boland教授2000年首次提出“生物3D打印”的概念[2]。

当前在医学界面临着用于器官移植的供体器官极度短缺的重大难题，为了解决供体器官的问题，学者们开展了多方面的研究。一些人工机械器官早已应用于人体，且已市场化，但具有副作用，如人工心脏会引起心功能下降；而异种器官移植特别是转基因动物器官的应用，虽然大大降低了移植后发生急性免疫排斥反应的概率，但潜在传播动物病毒的危险，且患者长期服用免疫抑制剂，可能会对心理产生一定的影响；再生医学通过基因治疗或干细胞移植在修复受损或疾病器官方面是一种有前景且相对更成熟的技术，但它只是在疾病的早期起作用，在疾病的后期或者对于已经发生器质性病变的组织，还需要器官移植；运用组织工程技术在体外培养各种人类细胞，将形成的仿生组织和器官用于器官移植，比如已经有了应用组织工程技术制造的胃、食管、脊髓、皮肤、骨等[3-7]；虽然有专家称该技术能够彻底治疗疾病[8-12]，但传统的组织工程技术目前尚无法实现工程化生产人造组织和器官，它还有很多不足之处[8]，譬如：支架技术的空间分辨率限制了细胞渗透到支架材料内部的速度，且不能实现高效率均匀贯穿整个支架；无法精确地将不同种类的细胞按照人体组织器官的结构准确定位，并形成类似于天然组织器官的三维结构；固体支架由聚乳酸(PLA)制成，较坚硬，在制造可收缩性的组织如心脏血管方面效果不好；用固体支架接种细胞会导致血管化的缺失，氧供不足，易引起组织或器官的坏死。

2003年Mironov等[13]基于生物自组装原理，提出“细胞打印”的设想。细胞打印技术能够将细胞、生长因子和支架结合在一起形成一个完整的整体结构，且各种类型的细胞能够按照正常的解剖结够准确定位，通过细胞、生长因子、支架之间的相互作用，行驶正常的生物学功能，因此，细胞打印被认为是组织工程中最有潜力的技术[14]。目前应用于细胞打印的技术主要有以下几种：

1 激光引导直写(laser-guided direct writing，LGDW)

20世纪90年代密歇根理工大学的Odde提出激光辅助的细胞直写方式[15]，该技术利用激光对材料的热冲击进行打印。关于该技术学者们提出了两种不同的理论：在液体中流动的细胞在激光光束的光压作用下沉积到成形平面上；将空心光纤中耦合入激光，细胞通过毫米量级的空心光纤后传输到目标成形层上。Odde等[16-17]利用激光对细胞产生梯度力来沉积细胞，实现活细胞的平面直写，并将其在三维空间上精确定位，结果显示细胞生长良好。Gao等[18]证明了活细胞也可被作为操控对象进行组装。Lin等[19]利用MAPLE DW打印了活性酵母细胞，证明有些打印过程中发生细胞损伤，但经过24 h可以自行修复，且打印细胞的修复能力与激光能量密度有关。Ringeisen等[20]和Barron等[21]证明了多功能鼠胚胎癌细胞和人类骨肉瘤细胞的细胞打印都可以采用激光直写方式实现。激光直写方式的优点：设备没有喷孔，不存在由于细胞悬浮液黏度大或者细胞凝聚造成的喷孔堵塞问题，因此可打印黏度高的生物墨水；激光直写操控细胞液滴的体积在fL至nL的范围内，分辨率可达到5 μm[22]。缺点：细胞容易受损伤[23]；由于激光打印需要预先制作细胞基片，所以多种细胞的混合打印难以实现；细胞打印效率低，不适合未来临床实际应用的需要。

2 立体光刻印刷(stereo lithography，SLA)

该技术需要控制激光逐层照射，最终成形为所需结构体三维模型。2002年，Liu等[24]用掩膜和紫外曝光固化利用光敏性水凝胶将人肝癌细胞与聚乙二醇双丙烯酸酯共混。2004年，Dhariwala等[25]采用光敏性水凝胶PEO与中国仓鼠卵巢细胞CHOB2细胞共混，他们均构建了含有细胞的立体结构。但紫外曝光对细胞有害，光固化诱导剂又具有与剂量相关的细胞毒性，这些都使细胞成活率降低低。

3 细胞直接三维受控组装技(three-dimension cell-assembly technique)

2003年由清华大学颜永年教授提出，通过控制计算机使细胞共混物进入针管或喷腔从而逐层打印出所需要的三维结构[26-27]。三维结构打印完成后为了使其在今后长期培养和植入的过程中长时间的保持稳定性，再使用戊二醛等进行后续的化学交联作用。结果显示90%以上细胞成活[28]。

4 声控打印(acoustic cell bioprinting)

声控细胞打印是利用传感器产生表面声波，达到在细胞悬浮液表面形成焦点的目的，通过控制声波使焦点处的声压超过液体表面张力，从而产生声控打印液滴[29]。Demirci等[30]和Utkan[31]运用声控技术打印了老鼠胚胎干细胞、纤维母细胞、肝细胞等，实验结果表明对于大多数种类的细胞来说，成活率都高于89.9%，证明声控方式可以打印活性细胞。声控打印优点：没有喷嘴，液滴的大小和喷射的过程都不受喷孔几何形状的影响，无细胞堵塞的现象；在喷射过程中细胞液滴不会受到高温和高压的影响产生伤害。缺点：在打印含单细胞液滴时，声控技术有时会打印出不含有细胞的液滴，可靠性较弱，重复性较差，有待进一步提高。

5 基于细胞喷射的生物绘图/生物三维打印技术(3D-Bioplotter)

Utkan[31]和Landers等[32]提出了基于细胞喷射的生物绘图技术，EnvisionTec于2002年使用了三维生物绘图机，并将其商用机型投向市场。这一设备的主要特点就是成形过程是在液体的绘图介质中进行的，喷头是由双层金属套筒包裹的玻璃针管，套筒间通热油有效的避免了喷头堵塞，挤出的压力源来自通过聚四氟乙烯封装连接的压缩空气。Fedorovich等[34]使用该技术打印了骨髓间充质干细胞，用于混合细胞的基质材料分别是藻酸盐、甲基纤维素、琼脂糖等水凝胶材料，结果发现细胞存活率不等，以藻酸盐为基质的细胞存活率可达90%。缺点：细胞打印效率低；细胞经打印后存活率低和功能丧失；打印成本昂贵。

6 喷墨细胞打印(Inkjet printing cells)

喷墨打印主要采用微热泡或压电驱动器喷射液滴，实现细胞打印。2003年克莱姆森大学的Boland首次提出细胞打印技术，打印机能够精确的将细胞悬液喷射到有良好生物学特性的热可逆凝胶上的指定位置，层层打印并固化，最终形成一个三维多细胞/凝胶结构体[8]。通过有效的控制最小凝胶层的厚度，实现层与层细胞有效的融合[35]。2003年，Xu等[36]利用热发泡式喷墨打印机打印了中国仓鼠卵巢细胞和胚胎运动神经元细胞，在大豆琼脂和胶原蛋白凝胶上形成预先设定好的结构，打印结束之后，通过测定胞质内乳酸盐脱氢酶的含量来判断细胞的活性，结果显示细胞保持超过90%的存活率，实现了活细胞打印[37]。2006年Xu等[38]用压电式喷墨打印人类成纤维细胞悬液，打印后94%～98%的细胞存活。Lee等[39]对比了打印前后大鼠胚胎神经元细胞和星形胶质细胞活力，发现细胞活力无差异。

2013年底，英国研究人员使用喷墨打印技术首次打印了鼠中枢神经系统的神经节细胞和神经胶质细胞，这两种成视网膜细胞通过特定电脉冲喷射而出，通过一个不到1 mm的喷嘴“打印”出来。结果表明，打印出的细胞生长正常。虽然该成果还处于初步研究阶段，但这是培育替代组织来修复受损或病变器官的一个实际步骤，为未来的视网膜修复提供了可能[40]。2014年蔡昊等[41]简化了压电式喷墨打印头的几何模型，并将模拟的实验结论应用到真实打印场景中，对比分析可知与模拟的实验数据基本吻合，这可以优化细胞打印相关的实验方案和相关工艺参数的设计。He等[42]建立了一个单细胞打印中细胞被喷射在介质表面这一过程的新模型，模拟表明打印过程中细胞经历显著应力变化(0～数十千帕)和局部的膜表面面积的应变(0～70%)。2015年Lee等[43]通过压电式喷墨打印喷射出的速度更快、精度更高液滴在聚酰亚胺表面形成精细线条图案。

喷墨打印的优点：喷嘴与细胞培养液是相互分开的，可以防止相互交叉感染；细胞打印的过程比较简单；成本低于其他打印方式。由于上述优势，喷墨打印技术成为目前应用较多的一种细胞打印的方式，但也有一些缺点：当打印黏度高的“墨水”时，喷嘴容易堵塞，影响打印效果；热喷墨打印时，喷嘴的最高温度在300℃以上，容易对细胞造成热损伤。

7 批量细胞打印(block-cell-printing)

美国休斯顿卫理公会研究院的研究人员开发了批量细胞打印技术，该技术是利用一个有钩状陷阱的硅胶模具达到活细胞打印的目的，这里活细胞进入模具是在微流体的引导下进行的，这项技术可以实现让细胞打印到任何表面和形状上。他们打印成功了癌变细胞和神经细胞还有脑细胞网格，这对于神经元信号转导和轴突再生的研究有很大的意义，可以说是阿尔茨海默氏病和其他神经退行性疾病患者的福音。BloC打印优点：可以半个小时内使用不同类型的细胞打印出细胞紧密到接近5 μm(大多数动物细胞在10～30 μm宽)的2D细胞阵列；细胞存活率高。缺点：不能实现多层结构打印[44]。

8 结 语

随着科学技术的进步，3D打印技术已经有了很大的发展。在细胞打印方面，该技术还停留在对单细胞打印的研究上，多细胞三维打印的研究还存在很多技术瓶颈，国内外的发展还都处于初级阶段，尤其是国内在这方面的报道还很少。而随着我国物质、文化生活水平，以及科学技术总体水平的提高，人们对生命质量和健康有了更高的要求。3D打印技术抛弃了传统的批量化固定尺寸成品生产的模式，可以便捷、快速的为患者量体裁衣，制备个性化的植入物，生产周期明显缩短，打破了传统制造业时间和空间的限制，具有重要的社会效益。细胞打印在给我们带来惊喜的同时也给我们带来了很多挑战。因此，细胞三维打印的研究尤其是多细胞三维打印的研究将是今后很长时间内三维打印的研究热点。

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Application and development of 3D printing technology in cell printing

WEI Yu-xue1,LIU Xiao-qiu1,LI Di1,LV Shan-shan2,WEI Zhen3.Department of Rehabilitation1,Department of Mucous Membrane2,Department of Dental Pulp3, Jilin University Dental Hospital,Changchun 130021,Jilin,CHINA

3D printing technology is a kind of rapid prototyping technology.This paper gives a brief summary of the concept,development and current situation of 3D printing,mainly introduces the application of 3D printing in cell printing,and analyzes the principle,advantages and disadvantages of various cell printing,as well as the development trend of 3D printing in the future.

3D printing;3D-Bioprinting;Tissue engineering;Cell printing

R329.2

A

1003—6350（2017）05—0801—04

2016-07-04)

国家自然科学基金(编号：813711841014238)；吉林省科技厅资助项目(编号：20160519017JH)

魏玉雪。E-mail：lisa44080809@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.05.038