胚胎监测仪延时摄像间隔时间对体外受精胚胎发育的影响

柴蓓蓓， 于成和，李正伟，许益娟，何培，张若鹏

(1大理大学临床医学院，云南大理671000；2大理大学第一附属医院)

胚胎监测仪延时摄像间隔时间对体外受精胚胎发育的影响

柴蓓蓓1， 于成和1，李正伟1，许益娟1，何培1，张若鹏2

(1大理大学临床医学院，云南大理671000；2大理大学第一附属医院)

目的 观察胚胎监测仪延时摄像间隔时间对体外受精胚胎发育的影响。方法 选取行体外受精治疗的受试者24对，获得168个受精胚胎，随机分为A、B、C、D组，每组42个胚胎。四组胚胎均在CO2培养箱中，在37 ℃、6% CO2条件下连续培养6 d并进行观察。采用Primo vision胚胎监测仪观察各组胚胎的发育过程，A、B、C、D组的拍摄时间间隔分别为5、10、15、20 min。胚胎监测结束后，找到每个胚胎对应的监测照片和模拟视频。记录胚胎多细胞发育所需时间,观察完成受精操作60 h时胚胎发育情况，计算各组形成优质胚胎和囊胚的比例，记录各组胚胎初次分裂的卵裂模式。结果 A组胚胎发育到5细胞所需时间长于D组，A、B组发育到6、7、8细胞所需时间长于D组，A组发育到6、7、8细胞所需时间长于C组(P均<0.05)。完成受精操作60 h时A组胚胎仍处在6细胞阶段，B组胚胎尚未发育到7细胞阶段，C组胚胎已分裂至7细胞阶段，D组为8细胞胚胎。C、D组形成优质胚胎、囊胚的比例均高于A组，C、D组形成囊胚的比例高于B组(P均<0.05)。C、D组初次正常卵裂胚胎比例高于A组，D组正常卵裂胚胎比例高于B组，C组非轴性卵裂、非二倍性卵裂胚胎比例低于A组，C组不均一性卵裂胚胎比例高于A组，D组非轴性卵裂胚胎比例低于A组和B组(P均<0.05)。结论 胚胎监测仪延时摄像间隔时间对胚胎发育存在一定影响，采用15 min和20 min的拍摄间隔较5 min、10 min对胚胎发育影响更小。

胚胎监测；延时摄像技术；辅助生殖技术；体外受精；胚胎发育；多细胞胚胎

研究[1]表明，通过体外培养胚胎的形态和发育速度可大致判断胚胎移植后的发育潜能。高潜能的胚胎相应会有更高的临床妊娠率和婴儿出生率，故选择更加科学有效的方法评估和选择最具发育潜能的胚胎是临床研究的热点[2]。胚胎发育是一个连续的过程，原核消失的时间、卵裂时间、卵裂模式、卵裂同步性对评估胚胎发育潜能有重要指导意义[3，4]。延时摄像技术可通过与培养箱整合在一起的高分辨摄影器材，利用瞬时曝光拍摄技术自动捕捉胚胎各阶段的高清照片并合成动态视频，用于研究和评估胚胎的发育情况。然而延时摄像技术在早期胚胎发育潜能及妊娠率评估方面的价值仍不明确[5]。目前各辅助生殖中心主要就延时摄像技术对早期胚胎筛选及其临床结局的影响进行研究，就延时摄像技术对胚胎发育的影响关注较少。所以，本研究观察了胚胎监测仪延时摄像间隔时间对体外受精胚胎发育的影响，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 连续选取2014年6月～2016年5月在大理大学第一附属医院生殖医学科行体外受精治疗的24对受试者。纳入标准：①采用标准长方案和短方案进行促排卵的女受试者年龄25～40岁；②女受试者为输卵管因素导致的不孕；③男受试者为少弱精或梗阻性无精症导致的不育；④所有入选周期取卵数目≥8个且受精率≥50%。排除标准：女受试者有子宫肌瘤、子宫腺肌病、子宫内膜异位症等疾病；女受试者存在反复胚胎着床失败、反复流产等预后不良状况。每对受试者中女方根据促排卵情况取不定数量的卵子，男方取适量的精子，最后共取得168个受精胚胎，随机分为A、B、C、D组，每组42个胚胎。本研究经大理大学附属医院伦理委员会批准，所有入组受试者签署知情同意书。

1.2 胚胎培养、检测及延时摄像方法 四组胚胎均在CO2培养箱中，在37 ℃、6% CO2培养条件下连续培养6 d并进行观察。采用Primo vision胚胎监测仪对各组胚胎的发育过程进行拍摄。Primo vision胚胎监测仪的光源为一个绿色LED灯，光照波长550 nm，采集每张照片所需的时间小于0.5 s。A、B、C、D组的拍摄间隔时间分别为5、10、15、20 min。

1.3 胚胎发育观察及评价 Primo vision胚胎监测仪监测结束后，从其配套软件中找到每个胚胎对应的监测照片和模拟视频。记录胚胎多细胞发育所需时间(即胚胎细胞发育到2细胞、3细胞、4细胞、5细胞、6细胞、7细胞、8细胞所需时间)；完成受精操作60 h时胚胎发育情况；完成受精操作后110～140 h间(由于各胚胎发育速度不同)多细胞发育结局(参照WHO评价标准，计算各组形成优质胚胎和囊胚的比例)；胚胎初次分裂的卵裂模式，其中异常卵裂模式包括非轴性卵裂(卵裂球分裂时分裂沟形态不规则，卵膜和卵胞质持续扭转)、非二倍性卵裂(一个卵裂球直接分裂成两个以上细胞)、不均一性卵裂(卵裂球直接分裂成大小不均的两个细胞，且两细胞直径相差五分之一以上)、卵裂球碎(卵裂球完全破裂成碎片)、发育停滞(卵裂球24 h内停止分裂)。根据Peter卵裂期胚胎评分系统对胚胎进行分级，共分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级，其中Ⅰ、Ⅱ级胚胎为优质胚胎。根据Garnder囊胚分级法对形成的囊胚进行分级，先根据囊胚的扩张和孵出程度将囊胚分成1～6级，3～6级囊胚需对内细胞团和滋养外胚层细胞进行评分，囊胚内细胞团评分分级包括A、B、C级，将Day 5评分≥3AA、3AB、3BA、3BB或Day 6～7评分≥4AA、4AB、4BA、4BB的囊胚判定为优质囊胚。

2 结果

2.1 各组胚胎多细胞发育时间比较 A组胚胎发育到5细胞所需时间长于D组，A、B组发育到6、7、8细胞所需时间长于D组，A组发育到6、7、8细胞所需时间长于C组(P均<0.05)。在整个观察期内，C组、D组胚胎多细胞发育时间无统计学差异。详见表1。

表1 各组胚胎多细胞发育时间比较±s)

注：与D组相比，*P<0.05；与C组相比，#P<0.05。

2.2 完成受精操作60 h时各组胚胎卵裂情况比较 完成受精操作60 h时A组胚胎细胞大小均匀，仍处在6细胞阶段,并未开始分裂；B组胚胎有两个细胞未完全完成分裂，尚未发育到7细胞阶段；C组胚胎由明显的7个大小较均匀的细胞组成，已分裂至7细胞阶段；D组胚胎为8细胞胚胎，但可见部分细胞碎片。详见图1。

注：A为A组6细胞胚胎；B为B组尚未完全发育至7细胞的胚胎；C为C组7细胞胚胎；D为D组8细胞胚胎。

图1 完成受精操作60 h时各组胚胎发育情况比较

2.3 各组优质胚胎、囊胚比例比较 至观察终点，A组形成优质胚胎、囊胚的比例分别为59.5%(25个)、47.6%(20个)，B组分别为61.9%(26个)、47.6%(20个)，C组分别为69.0%(29个)、54.8%(23个)，D组分别为64.3%(27个)、52.4%(22个)。C、D组形成优质胚胎、囊胚的比例均高于A组，C、D组形成囊胚的比例高于B组(P均<0.05)。C、D组优质胚胎和囊胚的比例差异无统计学意义。

2.4 各组胚胎初次卵裂模式比较 在观察期内，C组有一个胚胎卵裂球碎，B组有一个胚胎出现发育停滞，A组有一个胚胎未卵裂。C、D组初次正常卵裂胚胎比例高于A组，D组正常卵裂胚胎比例高于B组，C组非轴性卵裂、非二倍性卵裂胚胎比例低于A组，C组不均一性卵裂胚胎比例高于A组，D组非轴性卵裂胚胎比例低于A组和B组(P均<0.05)。详见表2。

表2 各组初次正常卵裂胚胎比例与异常卵裂胚胎比例比较(例)

注：与A组相比，*P<0.05；与B组相比，#P<0.05。

3 讨论

光照条件在体外培养人类胚胎发育中的影响一直备受争议。研究[6]表明，仅从波长角度讲，生物细胞对于光照波长敏感度由大到小依次为UV射线(200～400 nm)、蓝光(450～490 nm)、黄光(575～585 nm)、红光(620～750 nm)、绿光(500～575 nm)。但随着光通量增加(200、500、900 lux)，胚胎发育至囊胚期的比例依次减小。虽然延时摄像技术相较于传统的胚胎观察方式减少了胚胎暴露在光照下的总时间，但根据拍摄间隔不同暴露在光下的频率较普通观察方法大大提高。本实验使用Primo vision胚胎监测仪的光源，光照波长为550 nm，属低敏感波长。A、B、C、D组曝光总次数分别为1 700、860、570、430次，单次曝光时间平均为0.4 s。有学者[7]认为即便是低敏感波长光下，极短暂的暴露也足以产生影响胚胎发育的物质。所以拍摄间隔时间越短，曝光次数越多，不良物质的积累就越多。

受精卵经过卵裂和有丝分裂后形成多个细胞，发育成胚胎，胚胎再经过进一步生长形成囊胚。本研究对168个胚胎的发育过程进行了记录和分析。目前学界以卵裂时间来判断胚胎质量。研究[8]表明能够成功达成妊娠的囊胚有相同的卵裂模式和时间间隔。Hlinka等[9]发现第二次卵裂(即形成4细胞)的时间间隔为(11±1)h的囊胚有更高的着床率和更好的后期发展，本研究D组第二次卵裂时间间隔分别为14、13.3、12.6、12.2 h。Dal Canto等[10]发现可发育到囊胚阶段的胚胎发育到7细胞和8细胞的时间较发育到8细胞后出现发育阻滞的胚胎要早。

除正常卵裂外，其他卵裂模式均会不同程度地对胚胎发育潜能产生影响。故卵裂模式亦是选择优质胚胎的重要参考因素[11]。非二倍性卵裂和2细胞、3细胞、4细胞出现的时间也有一定关系，对胚胎的发育速度也存在影响。这种异常的卵裂模式可能与染色体异常有关[12]。不均一性卵裂是胚胎发育中最为常见的异常卵裂模式，有研究显示发生该种卵裂的胚胎非整倍体率和卵裂球多核率显著高于正常分裂的胚胎[13，14]。发育停滞的胚胎也多为非整倍体，其发育潜能亦较差。相较于其他卵裂模式，非轴性卵裂的胚胎有较好的发育潜能。

本研究结果显示，C组和D组的胚胎发育速度快于A组和B组，发育到7细胞和8细胞的时间短于A组，形成囊胚的比例也高于A组。C、D组初次正常卵裂胚胎比例高于A组，其优质胚胎率和形成囊胚率也较高。C、D组的胚胎较A、B组的胚胎有更好的发育结局，说明拍摄间隔时间对胚胎的发育存在一定影响。我们推测，置于光照下对胚胎发育产生负面影响的原因可能是诱发细胞膜上的不饱和脂肪酸与类脂产生氧化反应，从而导致细胞内活性氧簇(ROS)生成增多，包括过氧化氢、超氧化物、羟自由基、单线态氧及其他脂质过氧化反应的产物等[15]。大量ROS可导致细胞内重要结构被破坏、DNA损伤，从而对胚胎发育产生负面影响。另外，有研究[16～21]表明，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族中的亚型PLK1生成过少时，受精卵无法及时从有丝分裂进入早期胚胎阶段。光照对胚胎发育速度、初次卵裂模式的影响可能也与其导致细胞内PLK1生成减少有关。

综上所述，胚胎监测延时摄像的拍摄间隔时间对胚胎发育存在一定影响，选择15 min和20 min的拍摄间隔可能对胚胎的发育影响更小，更有利于提高移植成功率和妊娠率。然而，本研究纳入的样本量较少，关于最合适的延时摄影间隔时间还有待扩大样本量进一步证实。

[1] Akiyoshi E, Nobuhiko Y, Keiko T, et al. Developmental capacity and implantation potential of the embryos with multinucleated blastomeres[J]. J Reprod Dev, 2015,61(6):595-600.

[2] Pereira N, Brauer AA, Melnick AP, et al. Prognostic value of growth of 4-cell embryos on the day of transfer in fresh IVF-ET cycles[J]. J Assist Reprod Genet, 2015,32(6):939-943.

[3] Wang SS, Ding LJ, Zhao X, et al. Embryo selection for single embryo transfer on Day 3 Based on combination of cleavage pa-tterns and timing parameters in vitro fertilization patients[J]. J Reprod Med, 2016,61(5-6):254-262.

[4] Yang ST, Shi JX, Gong F, et al. Cleavage pattern predicts developmental potential of day 3 human embryos produced by IVF[J]. Reprod Biomed Online, 2015,30(6):625-634.

[5] Kong XY, Yang ST, Gong F, et al. The Relationship bet-ween cell number, division behavior and developmental potential of cleavage stage human embryos: a time-lapse study [J/OL]. PLoS One, 2016,11(4) :e0153697.PMID:27077739

[6] Ottosen L, Hindkjr Ingerslev J. Light exposure of the ovum and preimplantation embryo during ART procedures[J]. J Assist Reprod Genet, 2009,24(2-3):99-103．

[7] Oh SJ, Gong SP, Lee ST, et al. Light intensity and wavelength during embryo manipulation are important factors for maintaining viabili-ty of preimplantation embryos in vitro[J]. Fertil Steril, 2007,88(9):1150-1157．

[8] Robert M, Pawel K, Agnieszka K, et al. A predictive model for blastocyst formation based on morphokinetic parameters in time-lapsemonitoring of embryo development[J]. J Assist Reprod Genet, 2015,32(4):571-579.

[9] Hlinka D, Kalatova B, Uhrinova I, et al. Time-lapse cleavage rating predicts human embryo viability [J], Physiol Res, 2012,61(5):513-525．

[10] Dal Canto M, Coticchio G, Mignini Renzini M, et al. Cleavage kinetics analysis of human embryos predicts development to blastocyst and implantation[J]. Reprod Biomed Online, 2012,25(5):474-480．

[11] Yanhe L, Vincent C, Katie F, et al. Clinical significance of intercellular contact at the fourcell stage of human embryos, and the use of abnormal cleavage patterns to identify embryos with low impl-antation potential: a time-lapse study [J]. Fertil Steril, 2015,103(6):1485-1491.

[12] Athayde WK, Chen AA, Conaghan J, et al. Atypical embryo phenotypes identified by time-lapse microscopy：high prevalence and as-sociation with embryo[J]. Fertil Steril, 2014,101(6):1637-1648．

[13] Balakier H, Sojecki A, Motamedi G, et al. Impact of multinucleat-ed blastomeres on embryo developmental competence, morphokinetics, and aneuploidy[J]. Fertil Steril, 2016,106(3):608-614.

[14] Almagor M, Or Y, Fieldust S, et al. Irregular cleavage of early preimplantation human embryos: characteristics of patients and pregnancy outcomes[J]. J Assist Reprod Genet, 2015,32(12):1811-1815.

[15] Charalampos S, Paraskevi V, Christos V, et al. The effect of reactive oxygen species on embryo quality in IVF[J]. In Vivo, 2016,30(2):148-152 .

[16] Jordan-Philip W, Jesse K, Handel-Mary A, et al. Polo-like kinase is required for synaptonemal complex disassembly and phosph-orylation in mouse spermatocytes[J]. J Cell Sci, 2012,125(21):5061-5072.

[17] Lera RF, Potts GK, Suzuki A, et al. Decoding Polo-like kinase 1 signaling along the kinetochorecentromere axis[J]. Nat Chem Biol, 2016,12(6):411-418.

[18] O′Connor A, Maffini S, Rainey MD, et al. Requirement for PLK1 kinase activity in the maintenance of a robust spindle assembly check-point[J]. Biol Open, 2015,5(1):11-19.

[19] Sridharan V, Azuma Y. SUMO-interacting motifs (SIMs) in Polo-like kinase 1-interacting checkpoint helicase (PICH) ensure proper chromosome segregation during mitosis[J]. Cell Cycle, 2016,15(16):2135-2144.

[20] Tavernier N, Panbianco C, Gotta M, et al. Cdk1 plays matchmaker for the Polo-like kinase and its activator SPAT-1/Bora[J]. Cell Cycle, 2015,14(15):2394-2398.

[21] Wachowicz P, Fernández-Miranda G, Marugán C,et al. Genetic depletion of Polo-like kinase 1 leads to embryonic lethality due to mitotic aberrancies[J]. Bioessays, 2016,38(Suppl 1):S96-S106.

Effect of time-lapse interval of embryo monitoring on human embryonic developmentafter in vitro fertilization

CHAIBeibei1,YUChenghe,LIZhengwei,XUYijuan,HEPei,ZHANGRuopeng

(1CollegeofClinicalMedicine,DaliUniversity,Dali671000,China)

Objective To investigate the effect of time-lapse interval of embryo monitoring on human embryonic development after in vitro fertilization.Methods Totally 168 fertilized embryos were obtained from 24 couples who received the treatment of in vitro fertilization (IVF) and then were randomly divided into 4 groups: groups A, B, C and D, 42 embryos in each group. The embryos in the four groups were continuously monitored for 6 days in a CO2incubator at 37℃with 6% CO2. Each group′s embryo development was observed by Primo vision embryo monitor and the time-lapse interval in groups A, B, C and D was 5,10, 15 and 20 min, respectively. After the embryo monitoring, we found the corresponding monitoring photos and analog video for each embryo. We recorded the time of each embryo′s multicellular development and the embryo development at 60 h after in vitro fertilization. The proportion of high quality embryos and blastocysts in each group was calculated, and the first cleavage pattern of embryos in each group was recorded.Results The embryos in the group A needed more time to develop to 5 cells than that of embryos in the group D. The embryos in the groups A and B needed more time to develop to 6 cells, 7 cells and 8 cells than that of the embryos in the group D. The embryos in the group A needed more time to develop to 6 cells, 7 cells, and 8 cells than that of the embryos in the group C (allP<0.05). The embryo in the group A were still in 6-cell stage at 60 h after IVF, the embryo in the group B had not developed to the stage of 7 cells, the embryo in the group C was in the 7-cell stage and the embryo in the group D was 8-cell embryo. The percentages of high quality embryos and blastocysts in the groups C and D were higher than that of group A, the proportion of blastocysts in the group C and group D was significantly higher than that of group B (allP<0.05). The proportion of embryos which had normal cleavage in the group C and group D was higher than that in group A, and the proportion of normal cleavage in the group D was higher than that in the group B. The proportion of non-axis cleavage and non-diploid cleavage in the group C was lower than that in the group A, the proportion of embryos in the group C with an uneven cleavage was higher than that in the group A, and the proportion of non-axis cleavage embryo in the group D was lower than that in the groups A and B (allP<0.05). Conclusion The time-lapse interval of 5 min and 10 min may have some influence on the embryonic development and the effect of using 15 min and 20 min intervals on embryonic development is smaller than that of 5 min and 10 min.

embryo monitoring; time-lapse camera technology; assisted reproductive technology; in vitro fertilization; embryonic development; multicellular embryo

大理大学博士科研启动费项目(KYBS201612);九三学社大理州委立项调研课题。

柴蓓蓓(1991-)，女，在读研究生，主要研究方向为临床检验诊断学。E-mail: chaibb1991@sina.com

张若鹏(1974-)，男，博士，副主任医师，主要研究方向为生殖医学与妇科微创。E-mail: zrp263000@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.03.002

R711.6

A

1002-266X(2017)03-0005-04

2016-09-03)