高效液相色谱-三重四级杆质谱法测定豆制品中二甲基黄、二乙基黄

林 钦，黄红霞，张 莉，严 恒，李道霞，刘 美，李晓瑜，黄 瑛

（1.福建省产品质量检验研究院，福建 福州 350002；2.湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北 武汉 430070；3.四川省食品药品检验检测院，四川 成都 610097；4.国家食品药品监督管理总局，北京 100053）

高效液相色谱-三重四级杆质谱法测定豆制品中二甲基黄、二乙基黄

林 钦1，黄红霞1，张 莉2，严 恒2，李道霞3，刘 美3，李晓瑜4，黄 瑛3

（1.福建省产品质量检验研究院，福建 福州 350002；2.湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北 武汉 430070；3.四川省食品药品检验检测院，四川 成都 610097；4.国家食品药品监督管理总局，北京 100053）

建立一种同时测定豆制品中二甲基黄、二乙基黄的高效液相色谱-三重四级杆质谱（HPLC-MS/MS）方法。对提取溶剂及色谱条件进行优化，粉碎后的样品经乙腈提取，提取液以HPLC-MS/MS测定，外标法定量。二甲基黄、二乙基黄在3min内流出并完全分离，两者在0.05～10μg/L范围内相关系数r2均大于0.999，二甲基黄在0.5～50μg/kg的加标回收率为90.0%～93.4%，RSD为0.5%～5.1%，二乙基黄在0.5～50μg/kg水平的加标回收率在84.6%～93.8%，RSD为1.1%～4.6%，检出限两者均为0.2 μg/kg。该方法操作简捷、准确度和精密度高，适用于豆制品中二甲基黄、二乙基黄的检测。

二甲基黄；二乙基黄；高效液相色谱-三重四级杆质谱；豆制品

0 引 言

二甲基黄（methyl yellow）[1]、二乙基黄（ethyl yellow）[2-3]是偶氮苯类化工染料，不允许在食品中使用，有研究报道二甲基黄可能使实验动物患癌[4]。香港食物环境卫生署食物安全中心2014年12月6日发布了关于从台湾豆干制品检出二甲基黄的新闻，12月24日台湾食品药物管理部门公布了豆制品乳化剂中又验出另一种致癌物二乙基黄。为排查风险隐患，福建省产品质量检验研究院研究提出了食品中二甲基黄的检测方法，湖北省食品质量安全监督检验研究院提出了二乙基黄的检测方法。四川食品药品检验检测院作为全国豆制品抽检监测工作牵头单位，整合修改了两种检测方法，形成了同时测定豆制品中二甲基黄、二乙基黄的高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS），并经北京市海淀区产品质量监督检验所、河北省食品检验研究院等5家机构验证表明效果良好。目前文献报道的可用于二甲基黄的测定方法主要有HPLC[5-8]、LC-MS[9-12]、GC-MS[13]，液相色谱法的选择性较差、灵敏度低，易造成假阳性的检测结果。迄今尚未见文献报道食品中二乙基黄的检测方法。本文建立的方法可同时用于检测食品中的二甲基黄、二乙基黄，样品前处理较文献[12]报道的更为快速、简便，且测得二甲基黄的线性及回收率均较文献报道的更好。本方法将三重四级杆质谱用于同时检测二甲基黄和二乙基黄，具有很高的选择性和灵敏度，两对定性离子同时监测有利于测定准确性，能有效避免假阳性结果的发生。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

超高效液相色谱仪Waters Acquity UPLC系统配Quattro Premier XE串联四级杆质谱仪（美国Waters公司）；涡旋混匀器（美国热电公司，MIXII）；冷冻高速离心机 （美国贝克曼公司，Avanti J-E）；Milli-Q超纯水纯化系统 （美国 Millipore公司）；超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司，KQ-800KDE）；分析天平（赛多利斯北京有限公司，BSA224S）。

1.2 材料与试剂

二甲基黄、二乙基黄对照品，纯度均大于98%（德国Dr.Ehrenstorfer GmbH）；豆制品试验样品（超市购买和网购）；甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯（美国Fisher公司）；氯化钠为分析纯 （上海国药集团）；水为Milli-Q超纯水纯化系统制备的去离子水。

1.3 对照溶液配制

1.3.1 对照储备液

准确称取适量二甲基黄、二乙基黄对照品，分别用乙腈制成质量浓度为10.0 mg/L的对照储备液，4℃下保存，有效期6个月。

1.3.2 基质对照工作液

分别准确量取二甲基黄、二乙基黄对照储备液5.0mL，用乙腈定容至同一100mL容量瓶中，即得混合对照溶液，质量浓度均为0.5mg/L。准确移取混合对照溶液适量，用乙腈分别稀释至0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00 μg/L，即得混合对照系列溶液。

分别精密量取上述混合对照系列溶液1.0 mL，氮吹至近干后，用1.0 mL空白基质（不含二甲基黄、二乙基黄的样品溶液）复溶，即得基质对照工作溶液，质量浓度分别为0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00μg/L。

1.4 样品前处理

称取粉碎后的豆制品试样约2 g（精确至1 mg）置50mL的离心管中，加入5mL水，涡旋混匀，准确加入 20.0 mL乙腈，涡旋混匀，超声提取 30 min（温度控制在室温以下），再加入2.0g氯化钠，混匀后于10 000 r/min离心5 min，取上清液过0.2 μm有机滤膜，续滤液供测定。

1.5 液相色谱与质谱条件

1.5.1 色谱条件

表1 梯度洗脱程序

表2 二甲基黄、二乙基黄主要质谱参数

1.5.2 质谱条件

离子源：电喷雾（ESI）离子源；离子化模式：正模式；监测方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压3.50kV；源温度120℃；脱溶剂气温度400℃；脱溶剂气流量700 L/h；锥孔反吹气流量50 L/h；碰撞室压力2.7×10-3Mbar（1bar=1×105Pa）；电子倍增管电压650V。二甲基黄、二乙基黄定性离子、定量离子及碰撞能量等质谱参数见表2。

表3 回收率和精密度试验结果（n=6）

2 结果与验证

2.1 样品提取条件的优化

图1 二甲基黄、二乙基黄空白基质加标的液相色谱-串联质谱MRM色谱图

试验中尝试以甲醇作为提取溶剂，进行直接提取测定，但结果显示，甲醇提取干扰较大，不同添加水平的回收率均偏高，故选取乙腈+水作为提取溶剂，并采用盐析的方法分离乙腈与水。实验中比较了乙腈（20 mL）、乙腈+水（20 mL+2 mL）、乙腈+水（20mL+5mL）3种不同溶剂对二甲基黄、二乙基黄的提取效果。当只用乙腈提取时，回收率明显偏低，只有60%左右，而加入水后回收率明显上升；由于当水的加入量为2mL时，样品易结块，无法完全浸润，且在加入氯化钠后分层不明显，当水的加入量为5mL时则效果良好，因此，实验选取乙腈+水（20 mL+5 mL）作为提取溶剂。

2.2 色谱条件的选择

实验中考察了0.1%（ν/ν）甲酸水溶液-乙腈、0.5%（ν/ν）甲酸水溶液-乙腈两种流动相的分离效果，通过对比谱图，发现0.1%（ν/ν）甲酸水溶液-乙腈分离效果更好，峰形尖锐，对称性好，灵敏度更高，故选择0.1%（ν/ν）甲酸水溶液-乙腈作为流动相,通过优化洗脱梯度（见表1），二甲基黄、二乙基黄空白基质加标分离谱图见图1，空白样品谱图见图2。

图2 空白样品总离子流色谱图

2.3 线性范围及检出限

取基质加标对照工作液，依次进样测定，以质量浓度为横坐标，以定量离子峰面积为纵坐标，制作标准工作曲线，二甲基黄、二乙基黄在0.05～10 μg/L范围内线性关系良好（r2＞0.999）。取低浓度混合基质加标对照溶液（二甲基黄、二乙基黄质量浓度约为0.05 μg/L）进样，根据峰高计算信噪比为3时的检测限和信噪比为 10时的定量限，计算得二甲基黄、二乙基黄的检出限均为 0.2 μg/kg，定量限均为0.5 μg/kg。

2.4 回收率和精密度试验

取一豆干样品，分别加入二甲基黄、二乙基黄混合对照品溶液，按0.5，5，10，50μg/kg水平加标，每个水平平行检测6份，测得二甲基黄回收率为90.0%～93.4%，RSD为0.5%～5.1%。二乙基黄回收率为84.6%～93.8%，RSD为1.1%～4.6%（见表3）。

2.5 方法验证

在国家食品药品监督管理总局的组织下，有5家检验机构对该方法进行了验证，二甲基黄、二乙基黄在0.05～10μg/L范围内线性关系良好（r2＞0.999）。回收率结果显示，二甲基黄0.5～50 μg/kg水平的加标回收率为89.68%～90.61%，RSD为5.07%～10.94%，二乙基黄0.5～50μg/kg水平加标回收率在83.66%～100.01 %，RSD为5.65%～9.87%。

3 结束语

本实验考察了样品的前处理方法，优化了色谱条件和质谱参数，建立了同时测定豆制品中二甲基黄、二乙基黄的高效液相色谱-三重四级杆质谱（HPLCMS/MS）方法。所建方法二甲基黄、二乙基黄分离良好，两对定性离子同时监测有利于测定结果的准确性，能有效避免假阳性结果的发生。应用建立的方法检测国内豆干和腐竹200批，均未检出二甲基黄、二乙基黄。本检测方法前处理快速、简便，检测灵敏度高，定性结果准确。经5家检验机构验证，该方法线关系r2＞0.999、回收率二甲基黄为89.68%～90.61%、二乙基黄为83.66%～100.01%，相对标准偏差二甲基黄为 5.07%～10.94%、二乙基黄为 5.65%～9.87%，检出限两者均为0.2 μg/kg。本方法线性范围、回收率、精密度、检出限等均能满足检测要求和质量监管需要，适用于豆制品中二甲基黄、二乙基黄的同时检测。

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（编辑：莫婕）

Simultaneous determination of methyl yellow and ethyl yellow in soy products by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

LIN Qin1，HUANG Hongxia1，ZHANG Li2，YAN Heng2，LI Daoxia3，LIU Mei3，LI Xiaoyu4，HUANG Ying3
（1.Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality，Fuzhou 350002，China；2.Hubei Provincial Institute for Food Supervision and Test，Wuhan 430070，China；3.Sichuan Institute for Food and Drug Control，Chengdu 610097，China；4.China Food and Drug Administration，Beijing 100053，China）

To establish a method for determination of methyl yellow and ethyl yellow in soy products using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）. According to the optimization of extraction solvent and chromatographic conditions，the samples were extracted by acetonitrile and determined by HPLC-MS/MS using external standard method. Methyl yellow and ethyl yellow were separated completely within 3min.The linearity of methyl yellow and ethyl yellow was 0.05-10μg/L with correlation coefficients（r2）above 0.999.Recoveries ranged from 90.0%to 93.4%for methyl yellow at spiked levels ranging from 0.5μg/kg to 50μg/kg，and the relative standard deviations（RSDs）were in the range of 0.5%-5.1%.As for ethyl yellow，recoveries were 84.6%-93.8%at spiked levels ranging from 0.5 μg/kg to 50 μg/kg，and the RSDs were 1.1%-4.6%.The limits of detection were 0.2μg/kg.The method is rapid，simple，accurate and sensitive.It is suitable for determination of methyl yellow and ethyl yellow in soy products.

methyl yellow；ethyl yellow；HPLC-MS/MS；soy products

A

：1674-5124（2017）01-0055-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.01.012

2016-05-21；

：2016-07-18

林 钦（1970-），男，福建福州市人，高级工程师，博士，主要从事食品理化检验工作。

黄 瑛（1965-），女，陕西山阳县人，主任药师，硕士，主要从事食品安全标准研究。