胶红酵母菌降解毒死蜱发酵工艺研究

梁金钟，梅剑秋，王翼雪

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨 150076）

胶红酵母菌降解毒死蜱发酵工艺研究

梁金钟，梅剑秋，王翼雪

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨 150076）

为提高胶红酵母菌RM-DY21对有机磷农药的降解率，以YPD培养基为基础培养基进行碳源、氮源及培养条件优化。利用单因素和Box-Behnken响应曲面分析，确定了胶红酵母菌RM-DY21优化培养基配方为乳糖15 g/L，硫酸铵25 g/L，酵母浸粉10 g/L；胶红酵母菌RM-DY21降解有机磷农药的最佳培养条件为初始pH值5，培养温度30℃，培养时间36 h。利用优化后的发酵条件进行培养，结果显示胶红酵母菌RM-DY21对有机磷农药的降解率达到83.86%，比优化前提高了10.62%。

胶红酵母菌；培养基；发酵条件；优化

近年来，有机磷农药（OPs，Organophosphate，Organophosphorus Pesticides）以其高效、广谱、中等毒性等特点替代了有机氯而成为农业生产中使用最为广泛的一类农药，被广泛用于水稻、果树、蔬菜等粮食和经济作物中虫害的防治中[1]。据报道，我国农产品中农药残留超标率达20%左右[2]，这些农药的残留不仅影响食品安全，而且给人类健康和生态系统带来极为严重的不良后果，危害着人们的生命安全和身体健康。

微生物降解有机磷农药残留是解决有机磷农药污染的一条重要途径[3]，也被认为是降解有机磷农药最可靠、最高效的途径[4-6]。国内外倾向于用生物的方法解决有机磷农药引发的问题，使用生物修复法消除有机磷农药的污染。目前，国内外对于降解有机磷农药的细菌研究较多，真菌的研究还处于初步阶段[7-11]。真菌与细菌相比，具有遗传性状稳定、生存能力强、抗逆性强、耐高温、生物量大等优点[12]。

试验以诱变后的胶红酵母菌为出发菌株，以毒死蜱为降解底物进行降解试验，从培养基的优化、发酵条件优化方面进行研究，确定了优化培养基配方和适宜的培养条件，为下一步对菌种产酶试验的进一步研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胶红酵母菌（Rhodotorula mucilaginosa），哈尔滨商业大学发酵工程实验室保藏；毒死蜱乳油（50 g/100 mL），浙江新农化工股份有限公司提供；石油醚，天津市富宇精细化工有限公司提供。

1.2 仪器与设备

JPT型分析天平，江苏常州仪器厂产品；DZP-102型恒温振荡器，中国哈尔滨东联恒温电子技术开发有限公司产品；5100型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司产品；723N型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品；MLS-3780型高压蒸汽灭菌锅，上海中安医疗机械厂产品；BCN-1360B型超净工作台，苏州顺鑫净化科技有限公司产品。

1.3 培养基

1.3.1 基础培养基[13]（YPD培养基）

葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蒸馏水配制，于121℃条件下灭菌15 min，固体培养基加琼脂20 g/L。

1.3.2 发酵培养基[14]

在基础培养基中加入25 mg/L毒死蜱农药，蒸馏水配制，于121℃条件下灭菌15 min，固体培养基加琼脂20 g/L。

1.4 试验方法

1.4.1 菌种活化

在无菌条件下，将保存于固体斜面上的菌种挑取1环划线到基础固体培养基中，于28℃恒温培养箱中培养24～48 h，长出单菌落后挑取单菌落进行镜检，确定其纯度；然后将菌种接种到液体基础培养基中扩大培养，如此活化2～3次，作为后续试验备用菌液。

1.4.2 紫外分光光度法测定有机磷农药的残留量

在发酵培养基中接菌，在其中取发酵液再加入等体积的石油醚，将其放入空气浴振荡器中以转速150 r/min振荡10 min，以石油醚作为参比，在紫外可见分光光度计中测OD293值，并以毒死蜱浓度为横坐标（X）、毒死蜱于波长293 nm处吸光度为纵坐标（Y）绘制标准曲线。

1.4.3 有机磷农药降解率的计算

式中：X——农药的生物降解率，%；Cx——接菌处理培养液中农药质量浓度，mg·L-1；Cck——未接菌对照培养液中农药质量浓度，mg·L-1。

1.4.4 菌株RM-DY21生长与降解曲线的测定

将菌株RM-DY21接种于发酵培养基中，每隔2 h取样，分别用紫外分光光度法测培养基中的毒死蜱残留量，以时间为横坐标、吸光度为纵坐标绘制菌株的生长曲线与降解曲线。

1.5 不同培养基成分及含量对菌株降解有机磷农药的影响

1.5.1 不同碳源及其添加量对菌株降解有机磷农药的影响

将发酵培养基中的碳源除去，分别选择20 g/L葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、淀粉、果糖添加到发酵培养基中，按照2.0%接种量接种后于28℃，150 r/min的摇床中恒温振荡培养48 h，研究不同碳源对菌株生长及降解有机磷农药的影响。在确定了最适碳源基础上，分别调节最适碳源添加量10，20，30，40，50 g/L，考察其质量浓度对菌株生长和降解有机磷农药的影响，确定最适碳源质量浓度。

1.5.2 不同氮源及其添加量对菌株降解有机磷农药的影响

将发酵培养基中的氮源除去，分别选择20 g/L胰蛋白胨、酪蛋白胨、大豆蛋白胨、硫酸铵、硝酸钠作为氮源添加到发酵培养基中，提供菌株生长需要唯一氮源。按照2.0%接种量接种后于28℃，150 r/min摇床中恒温振荡培养48 h，研究不同氮源对菌株生长及降解有机磷农药的影响。在确定了最佳氮源基础上，分别调节最适氮源浓度为10，15，20，25，30 g/L，考察其浓度对菌株生长和降解有机磷农药的影响，确定最适氮源浓度。

1.6 培养条件优化

1.6.1 初始pH值对菌株生长及有机磷农药降解率的影响

在发酵培养基中，分别调节初始pH值为3，4，5，6，7。按照2%接种量接种后于28℃，150 r/min恒温振荡培养箱中培养48 h，通过测定菌体生长量及有机磷农药降解率确定最佳初始pH值。

1.6.2 培养温度对菌株生长及有机磷农药降解率的影响

在发酵培养基中，选择上述最佳初始pH值，按2.0%接种量接种种子液于液体培养基中，培养温度分别为26，28，30，32，34℃，置于转速150 r/min恒温振荡培养箱中培养48 h，通过测定菌体生长量及有机磷农药降解率确定最佳培养温度。

1.6.3 培养时间对菌株生长及有机磷农药降解率的影响

在发酵培养基中，选择上述最佳初始pH值及最佳培养温度，按2%接种量接种种子液于液体培养基中，以转速150 r/min于恒温振荡培养箱中培养，每隔2 h测定菌株对有机磷农药的降解率，从而确定最佳培养时间。

1.6.4 响应面分析法优化菌株降解有机磷农药的条件

综合单因素试验结果，利用Design Expert 7.0软件进行响应面设计，并对所得数据进行多元回归拟合及方差分析，得到菌株降解有机磷农药最佳条件培养方案。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

毒死蜱紫外分光光度计定量标准曲线见图1。

由图1可知，在0～200 mg/L范围内有良好的线性关系，回归方程为Y=0.002 18X+0.006 5，相关系数为R2=0.999 11。

图1 毒死蜱紫外分光光度计定量标准曲线

2.2 菌株RM-DY21的生长曲线

菌株RM-DY21的生长曲线见图2。

图2 菌株RM-DY21的生长曲线

由图2可知，在基础培养基中菌株RM-DY21适应期长、生长缓慢，38 h后生长趋势相对稳定。

2.3 不同碳源和氮源对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响

2.3.1 不同碳源对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响

在基础液体培养基中，以25 mg/L毒死蜱质量浓度的发酵培养基为基础，选择葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖、蔗糖、淀粉6种碳源，质量浓度均为20 g/L，按2%接种量接种于液体培养基中，培养温度28℃，置于150 r/min的摇床恒温培养36 h，测其菌体生长量与降解率；再选取最佳碳源分别配制10，15，20，25，30 g/L的发酵培养基，发酵培养并测其菌体生长量与有机磷农药降解率。

不同碳源对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响见图3，不同乳糖添加量对菌株RMDY21降解有机磷能力及菌体生长的影响见图4。

图3 不同碳源对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响

图4 不同乳糖添加量对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响

由图3可知，乳糖对菌株生长影响效果最好，麦芽糖、果糖和葡萄糖次之；乳糖对毒死蜱的降解影响效果最佳，麦芽糖次之。认为菌株利用双糖生长较好，易于利用，大都能有效参与酶合成，而对于蔗糖和可溶淀粉利用率低。综合考虑菌株生长与毒死蜱降解的影响效果，选取乳糖为最佳碳源。然后对于乳糖的不同添加量进行优化试验（如图4），得到乳糖添加量为15 g/L时降解率达到最高，菌体生长量也较高，当乳糖添加量继续增大，由于渗透压的升高，抑制了菌落的生长与繁殖，菌体生长量下降。故选15 g/L为乳糖最适添加量。

开展思想政治引领工作对于高职院校而言，应当从以下四个方面入手，形成从理论宣传和思想疏导，从生活实际到网络环境的全面倡导。帮助学生从各个方面感受到关怀，逐步培养并坚定自身的正确思想政治观念和体系。

2.3.2 不同氮源对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响

在基础液体培养基基础上，以25 mg/L毒死蜱质量浓度的发酵培养基为基础，选择酪蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、硫酸铵、硝酸钠6种氮源，质量浓度均为20 g/L，按2%接种量接种于液体培养基中，培养温度28℃，置于摇床恒温培养36 h，转速为150 r/min，测其菌体生长量与有机磷农药降解率；再选取最佳氮源分别配制10，15，20，25，30 g/L的发酵培养基，发酵培养并测其菌体生长量与有机磷农药降解率。

不同氮源对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响见图5，不同硫酸铵添加量对菌株RMDY21降解有机磷能力及菌体生长的影响见图6。

图5 不同氮源对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响

由图5可知，酪蛋白胨、大豆蛋白胨和硫酸铵对菌体生长的促进作用高于硝酸钠，而硫酸铵对毒死蜱的降解效果显著高于其他氮源。因此，综合考虑忽略次要指标菌体生长量，选取对毒死蜱降解效果最好的硫酸铵进行优化。由图6可知，硫酸铵为25 g/L时，降解率达到最高值；继续增大添加量使得培养基内环境发生改变，抑制菌体产酶活性，从而影响其对毒死蜱的降解效果。故选择25 g/L作为硫酸铵的最适添加量。

图6 不同硫酸铵添加量对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响

2.4 培养条件对菌体生长及有机磷农药降解率的影响分析

2.4.1 培养时间对菌体生长及有机磷农药降解率的影响

在液体发酵培养基中，选择上述最佳初始pH值、培养温度。按2.0%接种量接种种子液于液体培养基中，置于摇床恒温培养24，36，48，60，72 h，转速为150 r/min，发酵培养后取样，分别测得菌体生长量与有机磷农药降解率。

图7 不同培养时间对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响

由图7可知，随着培养时间的增加，菌体生长量和降解率均逐步提高，可推测该菌株的产酶为同步合成型，即在生长初期菌株便开始产酶，伴随着菌株的生长，产酶量逐渐上升，到达稳定期时产酶停止。

当培养时间到达36 h时，降解率达到最高；随着培养时间的继续增加，降解率基本保持平稳略有降低。因而，36 h为最佳培养时间。

2.4.2 不同初始pH值对菌体生长及有机磷农药降解率的影响

不同初始pH值对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响见图8。

图8 不同初始pH值对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响

在液体发酵培养基中，选择初始pH值分别为3，4，5，6，7，按2%接种量接种种子液于发酵培养基中，培养温度28℃，置于摇床恒温培养36 h，转速为150 r/min，发酵培养后取样，分别测得菌体生长量与有机磷农药降解率。

发酵液适宜的pH值环境对菌体生长及产酶条件具有一定的促进作用。由图8可知，在初始pH值为6时菌株生物量达到最高，而菌体降解有机磷农药的最适初始pH值为5，由于优先考虑降解效率，故选初始pH值为5。

2.4.3 培养温度对菌体生长及有机磷农药降解率的影响

在液体发酵培养基中，选择上述最佳初始pH值，按2%接种量接种种子液于液体培养基中，培养温度分别为26，28，30，32，34℃，置于摇床恒温培养36 h，转速为150 r/min，发酵培养后取样，分别测得菌体生长量与有机磷农药降解率。

不同培养温度对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响见图9。

图9 不同培养温度对菌株RM-DY21降解有机磷能力及菌体生长的影响

由图9可知，培养过程中培养温度对于菌体生长的影响并不显著，但对毒死蜱的降解效果具有一定的影响。由于培养温度是影响酶活力的重要指标，从而影响了菌株对有机磷农药的降解率。在30℃时菌体的生长与毒死蜱的降解都达到最优值，故选择30℃作为最佳培养温度。

2.5 响应面分析优化菌株降解有机磷农药的条件

2.5.1 响应曲面设计及结果分析

根据Box-Behnken原理，综合单因素试验结果，选取3个对菌株降解有机磷农药影响显著的因素，分别为初始pH值（A）、培养时间（B）、培养温度（C）为自变量，以有机磷农药降解率为响应值进行三因素三水平响应曲面设计试验。

响应面试验因素与水平设计见表1，响应面试验设计及结果见表2。

表1 响应面试验因素与水平设计

表2 响应面试验设计及结果

对初始pH值（A）、培养时间（B）、培养温度（C） 进行中心组合设计，利用Design Expert 8.0软件对表2中数据进行多元回归拟合得到二次回归方程为：

降解率（%）=82.70-1.29A+0.94B+0.97C+ 0.37AB-1.21AC+1.79BC-11.96A2-6.32B2-7.61C2.

按此回归方程建立响应值的方差分析表，对响应值的显著性进行分析来验证回归模型及试验结构的有效性。

响应面二次回归方程方差分析见表3。

该回归方程的相关系数R2=0.998 4，表明回归方程的拟合良好，与试验结果有99.84%的符合度；修正系数为R2adj=0.996 3，说明该模型具有较高的可信度。因此，可用该模型分析预测胶红酵母菌对有机磷农药的降解率。

表3 响应面二次回归方程方差分析

对二次多项回归模型进行方差分析（见表3）。模型p＜0.000 1，模型的F值为480.81，说明该模型显著；其中A，B，C，AC，BC，A2，B2，C2对菌体生长量影响显著；失拟项F值为0.49，表明失拟项对纯误差不显著，说明模型符合实际。各因素中一次项（A，B，C）、二次项（A2，B2，C2）及交互项（AC，BC）的p值均＜0.05，说明其对响应值影响显著；模型失拟项p值0.708 2＞0.05，从另一方面说明模型具有良好的拟合度。

2.5.2 响应曲面图形分析

由表3可知，初始pH值、培养温度、培养时间均为影响菌株RM-DY21对有机磷农药降解率的主要因素。

不同初始pH值与培养时间对降解率影响的响应曲面与等高线见图10，不同初始pH值与培养温度对降解率影响的响应曲面与等高线见图11，不同培养时间与培养温度对降解率影响的响应曲面与等高线见图12。

等高线密集且越趋向椭圆形表示两因素交互作用显著，反之则表示交互作用不显著。通过等高线图得到最优条件下各试验因子取值，图10和图12等高线越密集且越趋向椭圆形表明两因素交互作用明显，图10中等高线相对较圆说明交互作用不明显，该结果与表3方差分析结果一致。

通过 Design Expert 8.0软件优化后得到菌株RM-DY21对有机磷农药降解的最优条件为初始pH值4.94，培养温度30.16℃，培养时间36.34 h，预测降解率可达82.81%。按为试验方便可行，将最优条件修正为初始pH值为5，培养温度30℃，培养时间36 h。在优化后的培养条件下进行培养，确定模型与试验的相符性，得到实际降解率为83.86%。实际的降解率与回归方程接近，证明模型的可行性。

图10 不同初始pH值与培养时间对降解率影响的响应曲面与等高线

图11 不同初始pH值与培养温度对降解率影响的响应曲面与等高线

图12 不同培养时间与培养温度对降解率影响的响应曲面与等高线

3 结论

通过单因素试验，选出胶红酵母菌对有机磷农药降解率最佳碳源为乳糖，添加量为15 g/L；最佳氮源为硫酸铵，添加量为25 g/L；培养条件的最佳初始pH值为5，最佳培养温度为30℃，最佳培养时间为60 h。在单因素试验的基础上选取培养温度、培养时间和初始pH值为试验因素，以降解率为响应值，通过Box-Behnken的中心组合设计及响应面法对菌株RM-DY21降解有机磷农药发酵条件进行了优化，建立了菌株对有机磷农药降解条件的二次多项式模型，确定最佳条件为初始pH值5，培养温度30℃，培养时间36 h，菌株对有机磷农药的降解率为82.81%。经显著性检验证明，此条件下菌株对有机磷农药的降解率为83.86%，与理论值相差1.05%，表明应用响应曲面法优化菌株RM-DY21降解有机磷农药的条件是可行的，证明该模型具有可靠性。为后续菌株产酶研究的相关试验奠定了良好的基础。

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Optimization Fermentation of Rhodotorula mucilaginosa for Chlorpyrifos Degradation

LIANG Jinzhong，MEI Jianqiu，WANG Yixue

（Heilongjiang Key Laboratory of Food Science and Engineering，School of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150076，China）

Rhodotorula mucilaginosa are cultured for the degradation of organic phosphorus pesticide.To improve the degradation rate of organic phosphorus，carbon source，nitrogen source and fermentation conditions are optimized in YPD culture medium.With the results of single factor and Box-Behnken analysis，the optimum culture medium is as follows：lactose 15 g/L，ammonium sulfate 25 g/L，yeast extract 10 g/L and optimal culture conditions are as follows：initial pH 5，fermentation temperature 30℃，fermentation time 36 h.In the optimized medium，organic phosphorus pesticide degradation rate of Rhodotorula mucilaginosa reached to 83.86%which is 10.62%higher than that without optimization.

Rhodotorula mucilaginosa；medium；fermentation conditions；optimization

TQ920

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.01.013

1671-9646（2017）01a-0045-06

2016-11-03

梁金钟（1957— ），男，本科，教授，研究方向为微生物学与发酵工程。