顶空进样气相色谱法测定瑞替加滨中溶剂残留*

高海鹰，孟黎明，王海玲，关悦

(吉林省药物研究院，长春 130061)

顶空进样气相色谱法测定瑞替加滨中溶剂残留*

高海鹰，孟黎明，王海玲，关悦

(吉林省药物研究院，长春 130061)

建立瑞替加滨原料药中甲醇、异丙醇、乙酸乙酯残留溶剂的测定方法。以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂，DB–WAX123–7032石英毛细管柱为色谱分离柱，FID检测器，程序升温，氮气为载气。甲醇、异丙醇、乙酸乙酯能得到良好分离，甲醇在29.23～292.30 μg／mL范围内有良好的线性，线性相关系数为0.996，平均回收率为103.83%；异丙醇在49.96～499.60 μg／mL范围内有良好的线性，线性相关系数r=0.996，平均回收率为105.16%；乙酸乙酯在51.59～515.90 μg／mL范围内有良好的线性，线性相关系数为0.996，平均回收率为101.36%。甲醇、异丙醇、乙酸乙酯的检出限分别为0.036，0.213，0.062 μg／mL，测定结果的相对标准偏差分别为4.96%，4.52%，4.34%(n=6)。该方法灵敏度高，可用于瑞替加滨原料药中有机溶剂的检测。

顶空进样气相色谱法；瑞替加滨；甲醇；异丙醇；乙酸乙酯

瑞替加滨(Retigabine)其化学名称为N-[2-氨基–4-(4-氟苄氨基)苯基]氨基甲酸乙酯二盐酸盐，是一种合成的氨基吡啶类似物，具强效抗惊厥活性。瑞替加滨已经由FDA批准上市，疗效确凿，作用机制新颖，很有可能成为抗癫痫药物中的重磅炸弹级品种［1–4］，原料药在合成和精制过程中，使用了溶剂甲醇、异丙醇、乙酸乙酯，为控制药品质量，保证用药安全，需要对使用的溶剂进行残留量控制。

近年来，顶空毛细管气相色谱技术逐渐普及，成为药品中残留溶剂检测的首选方法，而关于瑞替加滨原料药中残留溶剂的测定和控制文献报道很少。参照《中国药典》2015年版四部规定［5］，笔者采用顶空气相色谱法同时检测原料药中甲醇、异丙醇、乙酸乙酯3种溶剂的残留量［6–9］并进行了方法学的验证。

由于异丙醇与乙酸乙酯的沸点非常接近，均在80℃左右，为了达到有效的分离，采用了程序升温，在220℃时保持4 min，进样口温度为200℃，保证溶媒二甲基亚砜全部被吹出，不会影响下一次进样的测定，避免了直接进样时原料药样品对检测的干扰和对色谱柱的污染。所建方法专属性好，准确度和灵敏度高，可用于瑞替加滨原料药中有机残留溶剂的质量控制。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱仪：7820A型，配有色谱工作站，美国Agilent公司；

顶空自动进样装置：7694E型，美国Agilent公司；

电子分析天平：MS405DU型，德国赛多利斯公司；

甲醇：分析纯，山东禹王实业有限公司；

异丙醇、乙酸乙酯：分析纯，北京化工厂；

二甲基亚砜(DMSO)：分析纯，天津大茂化学试剂厂；

瑞替加滨原料药样品：吉林省药物研究院。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：DB–WAX 123–7032石英毛细管柱(30 m×0.32 mm， 0.25µm)；柱温采用程序升温：初始温度为35℃(保持0 min)，以4℃／min升至60℃(保持0 min)，以40℃／min升至220℃(保持4 min)；进样口温度：200℃；分流比为5∶1；检测器温度：250℃；载气压力：68.95 kPa(10 Psi)；顶空瓶平衡温度：60℃；进样环温度：80℃；管线温度：120℃；平衡时间：30 min；进样体积：1 mL［10–13］；按外标法以峰面积计算含量。

1.3 溶液制备

1.3.1 混合对照品溶液

分别精密称取适量甲醇、异丙醇、乙酸乙酯，加入二甲基亚砜溶解并稀释，配制成甲醇、异丙醇、乙酸乙酯的含量分别为2.923，4.996，5.159 mg／mL的混合对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液

取适量瑞替加滨原料药样品，精密称定，加入二甲基亚砜溶解并稀释制得质量浓度约为0.5 g／mL的供试品溶液，。

2 结果与讨论

2.1 溶剂的选择

溶解性试验表明，瑞替加滨原料药在二甲基亚砜中溶解良好，且二甲基亚砜作为溶剂不干扰待检测残留溶剂的测定，故选二甲基亚砜作为溶剂。

2.2 顶空条件的选择

精密量取混合对照品溶液5 mL，置于20 mL顶空瓶中，密封，进行试验。考察顶空平衡温度在50，55，60，65，70℃时3种溶剂色谱峰面积的变化情况。

结果表明，随着加热温度的升高色谱峰高逐渐增大，当到达70℃时，色谱峰高有减小的趋势，且峰形变差,拖尾较严重，综合考虑选择平衡温度为60℃。在顶空平衡温度60℃的条件下，选择不同加热平衡时间进行试验，分别考察加热平衡时间为20，25，30，35，40 min时3种溶剂色谱峰面积的变化情况。结果显示：加热平衡时间小于30 min时，随着平衡时间的增加，色谱峰面积逐渐增加；加热平衡时间为30 min时色谱峰面积趋于稳定；加热平衡时间大于30 min时色谱峰面积反而减小。因此选择加热平衡时间为30 min。

表1 不同平衡温度时溶剂色谱峰面积

表2 不同平衡时间时溶剂的色谱峰面积

2.3 系统适用性试验

图1 系统适用性试验色谱图

由图1可知，各溶剂峰均能分开，峰形良好，没有杂质干扰。甲醇、异丙醇、乙酸乙酯色谱峰面积测定结果的相对标准偏差分别为1.97%，1.68%，2.24%(n=5)。《中国药典》中对系统适用性有明确要求，待测物的色谱峰理论塔板数一般不低于5 000，与其相邻色谱峰的分离度应大于1.5。实验中以混合对照品溶液为测试液，在优化色谱条件下进样，甲醇、异丙醇、乙酸乙酯各组分的保留时间分别为1.415，1.544，1.936 min；分离度分别为2.98，6.55，1.80；理论塔板数分别为17 561，19 533，31 330。结果表明建立的分析方法能够满足药典对系统适用性的要求。

2.4 标准工作曲线方程

精密量取混合对照品溶液0.5，1，2，3，4，5 mL置于5个50 mL容量瓶中，加入二甲基亚砜至标线，摇匀，得系列标准工作溶液。分别量取5 mL，置于20 mL顶空瓶中，密封，按实验方法测定。以待测组分的质量浓度X为横坐标，以峰面积Y为纵坐标进行线性回归。甲醇、异丙醇、乙酸乙酯的线性方程、相关系数及线性范围见表3。由表3可知，3种溶剂线性方程的相关系数均为0.996，符合检测质量控制要求。采用外标曲线法可实现药物中溶剂残留量的准确定量。

表3 工作曲线方程、线性范围

2.5 检出限

取混合对照品溶液逐级稀释，然后按样品分析方法平行测定6次，按照国际理论和化学联合会(IUPAC)的规定，以S／N＝3计算方法的检出限。经计算得甲醇、异丙醇、乙酸乙酯的检出限分别为0.036，0.213，0.062 µg／mL。所建方法灵敏度高，满足《中国药典》2015年版四部规定的安全检测要求。

2.6 精密度试验

移取混合对照品溶液6份，分别进行测定，记录各组分的峰面积，计算甲醇、异丙醇、乙酸乙酯色谱峰面积测定结果的相对标准偏差，结果见表4。

崔：这倒真是有些超乎我的想象了，对于很多作品，我能想象“音乐意识解决技术难点”的可能性，但是对于勃拉姆斯的《帕格尼尼主题变奏曲》是怎么做到的？这几乎是顶尖难度的钢琴作品。

表4 精密度试验结果

由表4可知，甲醇、异丙醇、乙酸乙酯色谱峰面积测定结果的相对标准偏差(RSD)分别为4.96%，4.52%，4.34%，均小于药物质量控制方法的规定[RSD不大于5.0%(n=6)]，可见所建方法的精密度良好，满足原料药溶剂残留的质量控制要求。

2.7 回收试验

2.7.1 甲醇回收率

精密称取瑞替加滨原料样品各0.5 g置于顶空进样瓶中。移取混合标准品溶液1 mL，用二甲基亚砜稀释至10 mL。精密量取稀释液5 mL分别置顶空进样瓶中，密封，使样品溶解，按实验方法测定，计算回收率，结果见表5。

2.7.2 异丙醇和乙酸乙酯回收率

精密称取瑞替加滨原料样品各0.5 g置顶空进样瓶中，精密量取浓度为2.571 5 mg／mL和2.657 5 mg／mL的异丙醇和乙酸乙酯的混合标准品溶液5 mL，分别置于顶空进样瓶中，密封，使其溶解，按实验方法测定，计算异丙醇和乙酸乙酯的回收率，结果见表5。

表5 回收试验结果(n=6)

实验结果表明，甲醇的平均回收率为103.83%，RSD为1.96%；异丙醇平均回收率为105.16%，RSD为2.40%；乙酸乙酯平均回收率为101.36%，RSD为1.85%。可满足准确度实验平均回收率在90%～110%，RSD小于5.0%的规定，表明本方法准确度良好。

2.8 样品测定

分别精密称取3批样品(批号为140924、140927、150107)各0.5 g，置顶空瓶中，加人二甲基亚砜溶解，摇匀，顶空进样测定，结果见表6。

表6 原料药残留溶剂的测定结果 %

由表6可知，3批样品中甲醇残留量分别为0.019%，0.042%，0.035%，异丙醇和乙酸乙酯均未检出。根据《中国药典》2015年版四部规定，甲醇属于第二类溶剂，限度为0.3%，异丙醇、乙酸乙酯属于第三类溶剂，限度为0.5%。可见被检的三批样品中甲醇的含量均小于限度，异丙醇和乙酸乙酯未检出，检测结果符合要求。

3 结论

采用顶空进样气相色谱法测定瑞替加滨中溶剂残留，经过方法学考察，方法专属性强，有较高的灵敏度。该方法精密度、准确度较高，可满足药物质量控制的要求，能对瑞替加滨原料药中残留溶剂进行有效监控。

［1］ 李明坤，冯永.新型抗癫痫药瑞替加滨概述［J］.药物流行病学杂志，2012，21(4): 196–197.

［2］ 张文彦，刘灿仿.新型钾离子通道开放剂瑞替加滨的药代动力学研究现状［J］.河北医药， 2012，34(14): 2 194–2 196.

［3］ 张璇，刘灵，焦晓翠.Kv7钾离子通道在血管平滑肌中的表达及功能［J］.中国药理学通报， 2013，29(4): 457–460.

［4］ Nodera H，Spieker A，Sung M，et al. Neuroprotective effects of Kv7 channel agonist, retigabine,for cisplatin-induced peripheral neuropathy［J］.Neurosci Lett，2011，505: 223–227.

［5］ 国家药典委员会.中国药典［M］.北京：中国医药科技出版社，2015.

［6］ ICH指导委员会.药品注册的国际技术要求(质量部分)［M］.北京：人民卫生出版社，2002: 79.

［7］ 胡昌勤.药物残留溶剂分析［M］.北京：化学工业出版社，2008.

［8］ 张晓娟，朱晓斌.气相色谱法测定来曲唑中甲醇、异丙醇、叔丁醇、乙酸乙酯以及DMF的残留量［J］.广东化工，2012，39(3): 166–167.

［9］ 顾红.药物合成过程中有机残留量的检测［J］.天津化工，2004，18(6): 52–54.

［10］ 江冬英，胡巧云.顶空进样法测定更昔洛韦的残留溶剂.中国医药导报［J］. 2011，25(8): 56–58.

［11］ 党民团，张雪妮.顶空色谱法测定琥珀酸美托洛尔中残留溶剂的研究［J］. 渭南师范学院学报，2014，(23): 29–32.

［12］ 邱宣，王爱迪.顶空气相色谱法测定罗氟司特原料药中残留溶剂的含量［J］.应用化工，2013，42(8): 1 541–1 543.

［13］ 宋劲燕，曹建英.顶空进样法测定罗氟司特中的残留溶剂［J］.中国当代医药，2014，21(12): 58–60.

美国化学会C & EN评选出2016年顶级科研成果

1 过程化学：冰箱大小的药物生产机器

麻省理工学院(MIT)的Timothy F.Jamison，Klavs F.Jensen，Allan S.Myerson和同事设计了一个冰箱大小的连续流系统设备，作为“迷你工厂”以最终制剂的形式来生产临床上直接可用的药物。该系统将药物生产体系上游的化学反应器单元与下游的沉淀、过滤、重结晶和制剂等单元组合在一起，还具有用于质量控制和过程评估的化学分析和计算模块。目前，该系统已经可以生产苯海拉明、盐酸利多卡因、地西泮、盐酸氟西汀的口服和外用液体制剂。下一步，MIT的科学家们希望将系统体积再缩小40%，增加合成更复杂药品的能力，并且将这种专利技术商业化。

2 高分子：首个“吃”PET塑料的细菌

聚对苯二甲酸乙酯(PET)是最常见的塑料之一，和其他塑料一样，在给人类生活带来很大便利的同时，也会给环境带来很大的压力。PET在美国已经是回收最多的塑料，但是仍有超过一半的PET塑料最终只能进入垃圾填满场，而这种聚合物中的酯键很强，很难自然降解。

日本京都工艺纤维大学的小田康平(Kohei Oda)和庆应义塾大学的宫本贤治(Kenji Miyamoto)等人今年报道了一种利用细菌来帮助降解PET的新方法，这是迄今发现的第一种可以“吃掉”PET塑料的细菌，它将PET作为其主要的碳源和能量来源。他们的研究小组筛选了来自一个塑料回收厂的样本，包括沉积物、土壤、废水和活性污泥，经过微生物筛选发现一种细菌能够在PET薄膜上成长。这种首个被发现能“吃掉”PET的细菌被命名为Ideonella sakaiensis。

3 材料学：液态金属的新应用

镓及其一些合金是一种液态金属，当暴露于空气中时，会自发形成薄的氧化物外皮，从而稳定液滴形态以及研究人员创造的其它任意图案。如果这种材料被挤压，氧化物外皮破裂，金属会恢复流动，直到重新生成氧化物外皮。

北卡罗来纳州立大学(NCSU)Michael D Dickey领导的团队利用镓(Ga)基合金的这种特性，制造了最小可到10 µm的聚合物包覆的eGaIn线，eGaIn是镓和铟的共晶混合物，熔点15.5℃，在室温下是液体。与普通的电线不同，由eGaIn制成的线可以很容易地被拉伸、弯曲和成形，同时还能保持导电性。

4 C–H键活化：亚甲基活化的新高度

美国斯克里普斯研究所(The Scripps Research Institute，TSRI)余金权(Jin-Quan Yu)教授和加州大学洛杉矶分校(UCLA)K.N.Houk教授等化学家今年实现了一个长久以来都未曾实现的目标：选择性活化有机化合物中最常见的基团之一——亚甲基(CH2)中特定的碳氢键并将其转化为手性中心。化学家们通过使用乙酰基保护的胺乙基喹啉配体，实现了单一亚甲基碳中心上前手性碳氢键的不对称钯插入，他们还把这些钯复合物用于脂肪族酰胺的β-位碳氢键不对称官能团化，使用双齿配体来加速碳氢键的活化对于避免底物诱导的环钯化背景反应是至关重要的，从而可以保证高的对映选择性。

5 诊断学：今年流行可穿戴传感器

智能手环、智能手表以及有些手机App可以让人们记录他们的心率、血压以及跑了多远，一些研究人员希望更进一步，开发能够分析人的汗水或环境中化学物质的设备，以监测健康状态、锻炼效果甚至化学品暴露风险。

6 药物发现：加强抗生素的“军火库”

传染性病菌和人类之间的战斗持续了成千上万年，而今年人类有可能稍稍占据优势，这是因为有两组科学家（哈佛大学Andrew G Myers研究小组、德国蒂宾根大学微生物学家Andreas Peschel和Bernhard Krismer领导的团队）设法升级了我们的抗菌“军火库”——一组制造了新的大环内酯类化合物，另一组则是在我们的鼻子里寻找新抗生素。

除此之外还有生物催化：酶法构建C–Si键；催化：单原子催化剂；结构生物学：三个生物大分子的结构。

（中国分析计量网）

Determination of Residual Solvents in Retigabine by Headspace Capillary Gas Chromatography

Gao haiying， Meng Liming， Wang Hailing， Guan Yue
(Jilin Institute of Pharmaceutical Research， Changchun 130061, China)

A method for determining methanol, isopropanol and ethyl acetate in retigabine material by headspace gas chromatography was established.The solvent media was dimethyl sulfoxide(DMSO), the seperation was carried on DB–WAX123–7032 capillary column with the FID detector at temperature programming, the carrier gas was nitrogen.The result showed that the three solvents were completely separated.The standard curve of methanol was linear in the range of 29.23–292.30µg／mL，r=0.996，the average recovery was 103.83%. The standard curve of isopropanol was linear in the range of 49.96–499.60 µg／mL，r=0.996，the average recovery was 105.16%. The standard curve of ethyl acetate was linear in the range of 51.59–515.90 µg／mL，r=0.996，the average recovery was 101.36%. The detector limit of methanol, isopropanol and ethyl acetate were 0.036，0.213 and 0.062 µg／mL, and the relative standard deviations of detection results were 4.96%，4.52% ,4.34%(n=6), repectively. The method is sensitive and it can be used for the detection of three residual solvents in retigabine.

headspace gas chromatography; retigabine; methanol; isopropanol; ethyl acetate

O657.3

：A

：1008–6145(2017)01–0012–04

10.3969／j.issn.1008–6145.2017.01.003

*吉林省科技发展计划项目(20130206017SF)

联系人：高海鹰；E-mail: ghy1998@126.com

2016–10–23