吐温40作为谷氨酸发酵促进剂的机制研究进展

赖木兰，万方，朱蔷云，陈雪岚

(江西师范大学 生命科学学院，江西 南昌，330022)

吐温40作为谷氨酸发酵促进剂的机制研究进展

赖木兰，万方，朱蔷云，陈雪岚*

(江西师范大学 生命科学学院，江西 南昌，330022)

吐温(Tween)是一种安全的非离子型表面活性剂，被广泛应用于乳化剂、油类物质的增溶剂和微生物发酵促进剂等。其中Tween 40被发现可以明显提高谷氨酸棒杆菌等棒杆菌属产谷氨酸的量，因此引起了相关科研工作者对其作用机制的关注。文中主要对Tween 40诱发谷氨酸棒杆菌高产谷氨酸的机制进行综述，并分析研究过程中亟待解决的问题及发展趋势。

吐温40；谷氨酸；谷氨酸棒杆菌；作用机制

吐温(Tween)化学名为聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，简称聚山梨酯，为两亲性物质，其分子中同时含有亲水基团(聚氧乙烯基)和亲油基团(脂肪酸链和烷基)；在水溶液中难解离，属于非离子型表面活性剂[1]。由于Tween的特殊性质，使其作为乳化剂[2-4]、增溶剂[5-6]以及湿润剂[7]等在石油、化工、塑料、机械、涂料、皮革、化妆品等工业生产中广泛应用。

根据脂肪酸链的不同，Tween主要分为Tween 20(聚环氧乙烷山梨糖醇单月桂酸酯)、Tween 40(聚氧乙烯山梨醇酐棕榈酸酯)、Tween 60(聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯)和Tween 80(聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)，其中Tween 40和Tween 80作为一种能显著提高目的产物产量的发酵促进剂常用于发酵工程中[8]。如LUO等[9]利用EscherichiacoliW3110-ZDrr重组菌进行发酵，当培养基存在Tween 80时，色氨酸产量提高到原来的两倍，达25.5 g/L；龙辉等[10]在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)发酵生产L-异亮氨酸对数期中后期(18h)添加Tween 80，单位细胞产酸的能力提高13.3%；在抗生素发酵中，朱凤等[11]在螺旋霉素发酵过程中加入Tween 80，其螺旋霉素产量提高11.9%，其发酵效价达28 176 U/mL；曹艳[12]在谷氨酸发酵过程中添加Tween 40，使得谷氨酸产量达到80 g/L。由此可见Tween给利用微生物生产的发酵工业带来了巨大的效益。

C.glutamicum作为一类遗传背景清楚且不产毒素的菌株，被广泛应用于各种氨基酸的生产并相应地作为试验对象进行了各种生理生化机制的研究。其中，Tween 40促进该菌株产谷氨酸的机制也得到逐步的剖析。从目前的文献报道分析，对其作用机制的认识主要经历了渗透模型、谷氨酸转运蛋白的结构改变机制以及谷氨酸合成网络的酶活调控机制3种。本文主要介绍Tween 40促进C.glutamicum分泌谷氨酸的3种机制，并结合本课题组的研究结果分析亟待解决的问题及发展趋势。

1 渗透模型

渗透模型认为在外界条件的诱导下，通过改变细胞表面结构的通透性，使谷氨酸能够通过渗透作用分泌到胞外，同时胞内谷氨酸的含量降低，解除了反馈抑制，增加了谷氨酸合成。细胞表面结构的改变包括细胞壁结构和细胞膜磷酯成分的改变，下面分别就Tween 40对这两种结构的改变与促进谷氨酸高产的相关性进行介绍。

1.1 细胞壁结构的改变

C.glutamicum细胞壁主要是由糖肽化合物聚合而成的多层网状大分子结构所组成，其细胞壁外层另有一层分支菌酸层，它通过阿拉伯半乳聚糖以共价键的形式与肽聚糖层紧紧相依，成为了细胞的第一道渗透屏障。分支菌酸层含有大量的糖脂，如海藻糖分支菌酸脂等。GEBHARDT等[13]构建海藻糖缺失菌株LP△treS△otsA△treY，使分支菌酸的合成受阻，发现其赖氨酸、谷氨酸产量增加。由此说明分支菌酸层在氨基酸分泌中具有一定的渗透屏障的作用。HASHIMOTO等[14]通过气象色谱-质谱(GC-MS)分析发现在Tween 40诱导的条件下，C.glutamicum产谷氨酸的量得到提高，而其分支菌酸的含量降低到原来的60%。因此认为Tween 40可以通过影响分支菌酸层的合成，从而影响细胞壁的渗透性，使谷氨酸的分泌量增加。

1.2 细胞膜磷酯成分的改变

细胞膜是谷氨酸分泌到胞外所必须通过的一道屏障，细胞膜的完整性对谷氨酸的分泌有显著影响。脂类是细胞膜重要组成成分，其由dtsR编码的乙酰-CoA羧化酶以及其他一系列酶催化反应形成，脂类成分的改变会影响细胞的通透性。KUMAR等[15]在C.glutamicum发酵时添加Tween 40，并监测DtsR蛋白的表达量，结果发现随着Tween 40添加量的增加，DtsR表达量呈明显的下降趋势，谷氨酸的产量却有显著的提高。究其原因，发现DtsR合成受阻会改变细胞膜磷脂成分，从而提高了细胞膜分泌谷氨酸的阀值。为了探究Tween的作用靶点是细胞膜，NAMPOOTHIRI等[16]分别过表达与磷脂合成有关的基因，包括acp、fadD15、cma、cls、pgsA、cdsA和plsC等，发现重组菌的磷脂的组成成分发生了改变，且无Tween诱导时，谷氨酸的产量由原始菌的0.2 mmol/L分别变为4.8、0.3、0.3、7.1、3.6、3.8和0 mmol/L，这结果显示谷氨酸的分泌受到细胞膜磷脂组成成分的强烈影响。当原始菌受1.5 mg/mL Tween 60或Tween 40诱导时，谷氨酸的产量可以达到91 mmol/L；当上述重组菌分别受1.5 mg/mL的Tween诱导时，过表达acp、fadD15或cdsA的重组菌的谷氨酸的积累反而降低了，且acp过表达使得谷氨酸产量显著降低，降为了24 mmol/L；而过表达cma、cls或plsC的重组菌积累谷氨酸的能力增加，谷氨酸产量均超出100 mmol/L，其中过表达plsC的重组菌谷氨酸产量达到109 mmol/L。这些现象作者认为Tween依赖的谷氨酸分泌可能是通过激活或失活与磷脂合成相关的基因，从而改变细胞膜磷酯组成，进而影响谷氨酸的产量。

2 谷氨酸转运蛋白结构改变机制

渗透模型使人们普遍认为谷基酸的分泌即仅仅是跨膜扩散机制，但此模型无法解释在胞外大量积累谷氨酸而胞内谷氨酸浓度不受渗透作用的影响。在C.glutamicum中，赖氨酸、异亮氨酸以及苏氨酸等都是由相应的输送载体所介导输送至细胞外。由此科研工作者推断，细胞膜上可能存在一种转运谷氨酸的蛋白质。NAKAYAMA等[17]对C.glutamicumΔNCgl1221菌株给予诱导剂(Tween 40，青霉素等)处理时，发现其谷氨酸分泌受阻，胞内谷氨酸积累，这结果实际上否定了渗透模型；若过表达NCgl1221，则胞外谷氨酸积累幅度大量提高；作者将C.glutamicum的NCgl1221进行序列比对分析，发现它与E.coil的一种机械敏感性通道膜蛋白YggB具有很高的同源性。HASHIMOTO等[18-19]通过电生理学分析确定NCgl1221是一种机械敏感性通道膜蛋白，并确认其能特异性地转运谷氨酸。YAO等[20]将NCgl1221与绿色荧光蛋白进行融合表达，确定了NCgl1221蛋白位于细胞膜上且NCgl1221是一种C端在胞质内的四次跨膜蛋白质；当诱导剂Tween 40的存在时，脂肪酸的合成会因为受到抑制而改变膜的脂质组成，这种改变使膜的张力及渗透性发生改变的同时也使机械敏感性离子通道膜蛋白——NCgl1221谷氨酸转运蛋白的空间构像也发生了相应的改变，而这种改变使之运输谷氨酸到细胞外的能力大幅提高，从而提高谷氨酸的产量。这个机制能解释渗透模型所不能回答的问题。虽然以上研究否定了渗透模型，但与NAMPOOTHIRI等研究结果不冲突，是其研究结果的深入，正是细胞膜磷脂成分的改变等而导致NCgl1221谷氨酸转运蛋白的空间构像发生变化，从而促进了谷氨酸的分泌。

图1 谷氨酸棒杆菌中谷氨酸的生物合成途径Fig.1 The biosynthetic pathways of glutamate in Corynebacterium glutamicum

3 谷氨酸合成网络的酶活调控机制

目前报道Tween 40影响谷氨酸合成网络的酶活调控包括α-酮戊二酸脱氢酶复合物(α-oxoglutarate dehydrogenase complex，ODHC)的酶活调控和丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC)的酶活调控。

3.1 α-酮戊二酸脱氢酶复合物(ODHC)的酶活调控

谷氨酸的生物合成网络主要包括糖酵解途径(glycolytic pathway，EMP)，三羧酸循环途径(tricarboxylic acid cycle，TCA)，乙醛酸循环途径以及回补途径等，如图1所示。α-酮戊二酸作为谷氨酸的前体物质是三羧酸循环途径的中间代谢产物，其可通过ODHC催化形成琥珀酰-CoA，也可在谷氨酸脱氢酶的催化下形成谷氨酸。因此，ODHC的表达如受到抑制，则代谢流将集中流向谷氨酸合成途径[21-22]。

在谷氨酸棒状杆菌中，ODHC是由3种亚基酶组成的复合物，这3种亚基酶分别是odhA编码的α-酮戊二酸脱氢酶，sucB编码的二氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶以及lpd编码二氢硫辛酰胺脱氢酶。KIM等[23]发现在Tween 40存在的情况下，ODHC的活性下降，谷氨酸的产量会得到提高。可见Tween 40能降低ODHC的活性从而提高谷氨酸产量。

ODHC的活性受OdhI磷酸化的影响，其主要机制是未磷酸化的OdhI可以通过其FDH区域与ODHC中的OdhA亚基结合，从而抑制ODHC的活性；蛋白激酶G(PknG)可以对OdhI的第14位苏氨酸进行磷酸化，磷酸化的OdhI可以从OdhA上脱离下来，从而解除对ODHC的抑制[24]。SCHULTZ等[25]发现除PknG外，还有3种磷酸激酶可以磷酸化OdhI，即PknA、PknB、PknL，但PknB起主要作用；作者同时发现由ppp编码的磷酸蛋白磷酸酶Ppp也可将磷酸化的OdhI去磷酸化。综上所述，ODHC的活性受到OdhI的磷酸化状态的调控。但是Tween 40是如何降低ODHC的活性？是否也对OdhI磷酸化水平有影响？为了探索Tween 40等诱导剂抑制ODHC酶活性的具体机制，Kim等[26]通过Western Blotting定量分析在Tween 40存在的条件下，谷氨酸大量生产时其胞内OdhI的磷酸化水平。结果发现，在Tween 40诱导的条件下，磷酸化和未磷酸化的OdhI均有所提高，但未磷酸化的OdhI明显高于磷酸化的OdhI。由此可见，Tween 40促进谷氨酸高产的可能原因是其可以增加未磷酸化的OdhI的含量从而抑制ODHC的活性，最终增加了谷氨酸的产量。

3.2 丙酮酸羧化酶的酶活调控

丙酮酸羧化酶(PC)是三羧酸循环回补途径中的关键合成酶，其催化丙酮酸合成草酰乙酸。此回补途径还可以通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenopyuvate carboxylase, PEPC)催化磷酸烯醇式丙酮酸合成草酰乙酸，如图1所示。在TCA循环中，草酰乙酸和乙酰-CoA合成为α-酮戊二酸的前体物质柠檬酸，而α-酮戊二酸是谷氨酸的前体物质，因此草酸乙酰合成的增加则能提高谷氨酸的合成。PETERS等[27]通过过表达编码PC基因已证实可以提高谷氨酸的积累。SHIRAI等[28]建立葡萄糖13C标记的代谢通量分析，通过气相色谱质谱法实时测定胞内蛋白质氨基酸13C丰度，分析在Tween 40的诱导下C.glutamicum在谷氨酸生产过程中两条回补途径所扮演的角色。结果表明在生长期，由PC催化丙酮酸合成草酰乙酸的途径代谢通量几乎为零，由PEPC催化的磷酸烯醇式丙酮酸合成草酰乙酸的途径代谢通量为38%；在谷氨酸生产期，PC催化的途径代谢通量明显增加达到56%，而由PEPC催化的途径代谢通量则无明显变化。这与HASEGAWA等[29]在Tween 40诱导条件下，对丙酮酸支点各酶活进行测定，发现PC的酶活逐步提高至在15 h达到最高酶活，提高了1.4倍；而PEPC酶活无明显变化这一实验结果吻合。由此可见，在Tween 40诱导谷氨酸生产过程中，PC扮演着至关重要的角色，其酶活提高则此回补途径代谢通量也明显增加，促使草酰乙酸增加的同时也为谷氨酸的合成提供更多的前体物质——α-酮戊二酸。以上研究结果表明，在菌株不同生长阶段，Tween 40可能特异地调控PC的酶活，在谷氨酸生产期，Tween 40能够激活PC酶，最终诱导谷氨酸的高产。以上机制的揭示进一步补充了Tween 40能提高C.glutamicum合成谷氨酸的本质。

4 问题与展望

Tween 40作为发酵促进剂，对其引发C.glutamicum高产谷氨酸的机制是经历了逐步剖析的过程。从在Tween 40作用下细胞壁及细胞膜的变化与谷氨酸高产的关联、谷氨酸运输蛋白的发现及在Tween 40作用下其空间构像发生的变化与谷氨酸高产的关联、在Tween 40作用下谷氨酸合成途径中多种酶活性的变化与谷氨酸高产的关联等多方面的研究，获得了主要包括渗透模型(虽然渗透模型已被否认，但细胞膜磷脂成分的改变却与谷氨酸转运蛋白结构的改变相关)、谷氨酸转运蛋白结构的改变和谷氨酸合成网络酶活的调控这些机制，也正是由于这些Tween 40引起的改变共同促进了谷氨酸的高产。同时，本课题组在敲除钝齿棒杆菌(与谷氨酸棒杆菌同源性达到99%)谷氨酸运输蛋白NCgl1221、研究Tween 40增加精氨酸(谷氨酸是精氨酸的前体物质)产量的机制时，发现一个新的现象，即磷酸戊糖途径的基因zwf的转录水平大幅提高且相应胞内的NADPH积累增加[30]。因此，从以上Tween 40对微生物发酵的影响机制分析，认为依然存在需要进一步阐述的问题，包括(1)Tween 40与合成磷脂相关基因的作用靶点；(2)Tween 40如何降低ODHC的酶活，与OdhI磷酸化程度的关系，其磷酸化程度又是如何调控的；(3)Tween 40如何调控PC酶和PEPC酶活性；(4)Tween 40如何提高磷酸戊糖途径的表达，从而提高NADPH的供应等。相信这些问题可以通过转录组、蛋白组学等手段进一步揭示，更全面系统地了解Tween 40诱发谷氨酸棒杆菌等棒杆菌属高产谷氨酸本质，从而充分利用使其在微生物发酵工业领域发挥更大的作用。

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Researches on the mechanism of Tween 40-triggered glutamate overproduction

LAI Mu-lan, WAN Fang, ZHU Qiang-yun, CHEN Xue-lan*

(School of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022,China)

Tween, as a kind of safe nonionic surfactant, has been widely used in emulgator, solubilizer of oily substances, accelerant of microbial fermentation, etc. Among them, Tween 40 was found to significantly improve the yield ofCorynebacteriumglutamicum-producing glutamate, which caused the related researchers to focus on its mechanism. In this article, the research advances on Tween 40-triggered glutamate overproduction byCorynebacteriumglutamicumwere mainly discussed, and problems demanding prompt solution in research process and development trend were analyzed.

Tween 40; glutamate;Corynebacyeriumglutamicum; mechanism

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701046

学士(陈雪岚教授为通讯作者,E-mail: xuelanchen162@163.com)。

国家自然科学基金(31360219)；江西省自然科学基金(2015BAB)

2016-06-05，改回日期：2016-07-25