采后赣南脐橙热水处理的保鲜效果

林丽萍，叶明娥，陈于陇 ，张凤英，吴国平*

1(江西农业大学 南昌市农产品加工与质量控制重点实验室，江西 南昌，330045) 2(江西省果蔬采后处理关键技术与质量安全协同创新中心，江西 南昌，330045) 3(广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东 广州，510610)

采后赣南脐橙热水处理的保鲜效果

林丽萍1,2，叶明娥1，陈于陇3，张凤英1，吴国平1*

1(江西农业大学 南昌市农产品加工与质量控制重点实验室，江西 南昌，330045) 2(江西省果蔬采后处理关键技术与质量安全协同创新中心，江西 南昌，330045) 3(广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东 广州，510610)

为研究热水处理技术在柑橘类水果采后保鲜中的应用可行性。试验以江西省赣南脐橙为试材，设计2因素(温度和时间)5水平均匀试验，分别考查热水处理后赣南脐橙贮藏品质相关指标(呼吸速率、可溶性固形物含量和硬度)和贮藏发霉情况，并研究了热水处理对赣南脐橙青、绿霉病原菌(意大利青霉和指状青霉)孢子的致死作用机制。综合分析，得出赣南脐橙热水处理较优条件为：50 ℃，5 min。该条件处理后的赣南脐橙呼吸速率最低，为42.89 mg CO2/(kg·h)。 25 ℃温箱保藏20 d，该处理组赣南脐橙均未发病，优于对照组。加赣南脐橙皮到病原菌孢子悬液中进行热水处理，病原菌孢子死亡率检测及Hoechst 33342/PI荧光双染色结果显示，赣南脐橙皮成分与热对病原菌有协同抑杀作用，病原菌孢子细胞膜受到损伤。50 ℃，5 min热水处理应用于赣南脐橙采后保鲜具有可行性。

赣南脐橙；热水处理；保鲜效果；病原菌

江西赣南自上世纪70年代引种栽培脐橙成功以来，目前已发展成为我国脐橙主产区，约占我国脐橙总种植面积的60%。赣南脐橙种植不仅促进了当地农业结构优化和农民脱贫致富，也使赣南脐橙成功跻身全球三大脐橙品牌之一[1-2]。2014年，赣南脐橙以其优良的品质作为江西省唯一产品，入围商务部、质检总局中欧地理标志协定谈判的地理标志产品清单[3-4]。赣南脐橙以纽荷尔脐橙为主栽品种，占赣南脐橙总种植面积的90%。由于品种单一，采收期高度集中，加之采后初、深加工严重不足，使得赣南脐橙采后贮藏保鲜成为调控市场供给、维持销售价格的重要方式。然而，脐橙等柑橘类果品收获、贮运、保鲜期间极易遭受柑橘青、绿霉菌病害[5]，导致果品腐烂变质，造成的经济损失甚至可达10%～30%[6]，严重影响了果农的收益和产业的健康发展。

目前脐橙霉菌病害的防控，主要是用化学杀菌剂对果品进行喷雾、浸泡等贮藏保鲜预处理[7-8]，取得了较好的效果。但这一方法有其缺点，如农药在果品内残留，霉菌抗药性的产生，药效维持时间短等。目前，一种环境友好、无药残的新型贮藏保鲜技术——热水处理，即用热水喷淋果品，以有效预防柑橘类果实采后霉菌病的发生[9-10]。热水处理采用的温度一般在43～53 ℃，时间维持数分钟至2 h[11-12]，具有消毒效果好，无污染、能耗低、便于操作、可清洁果实等优点，已发展成为柑橘类果品贮藏保鲜的一种实用技术。但是，目前热水处理在赣南脐橙采后贮藏、保鲜中防控霉菌病害的应用条件和机制鲜见报道。

由于果实本身的呼吸、代谢、蒸腾等作用，使得果品在贮藏过程中会出现失重、软化、风味变差等品质劣化现象，最终会缩短果品贮藏期，降低其价值[13-15]。本文主要研究热水处理对赣南脐橙贮藏品质相关指标(呼吸速率、硬度和可溶性固形物含量)、赣南脐橙贮藏发霉情况的影响；并进一步探索热水处理对赣南脐橙青、绿霉菌孢子致死作用机制，以解析热水处理防控霉菌病害的可行性和生物机制，为赣南脐橙霉菌病害的物理防控措施提供实验数据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 病原菌

意大利青霉(Penicilliumitalicum)和指状青霉(Penicilliumdigitatum)：中国农业微生物菌种保藏中心。

1.1.2 赣南脐橙

赣南脐橙，来自赣州市安远县果园树龄为8.5年的纽荷尔脐橙。采收期为2014年11月中旬，果实大小、成熟度(九成熟)均匀一致，平均单果重200 g左右，表皮完好，无伤口。

1.1.3 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1000 mL，琼脂20 g，pH自然，121 ℃灭菌20 min。作病原菌的活化、培养及计数用。

再生培养基： NaNO32 g ，KCl 0.5 g ，K2HP41 g ，MgSO40.5 g ，蔗糖3 g ，酵母膏5 g。 以0.7 mol/L NaCl配制1 000 mL，pH自然。作病原菌孢子荧光染色用。

1.1.4 主要试剂

蜗牛消化酶(90 U/g)，上海研域生物科技有限公司，Hoechst33342/PI双染试剂盒，购于南京建成生物工程研究所；渗透压稳定剂，用0.1mol/L pH 5.5～6.0磷酸缓冲液配制0.7 mol/L NaCl。

1.2 仪器与设备

LDZX-40B自动立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；SHP-160型生化培养箱，上海三发科学仪器有限公司；HH-6数显恒温循环水浴锅，国华电器有限公司；WYT-J手持式折光仪，成都青羊华瑞光学仪器厂；GY-1果实硬度计，北京时代恒宇科技有限公司；3051H果蔬呼吸测定仪，均方理化科技研究所；HC-2518R高速冷冻离心机，安徽中科中佳学仪器有限公司；ZEISS Ver.A1荧光显微镜，德国卡尔蔡司光学仪器公司；BK5000数码生物显微镜，重庆奥特光学仪器有限责任公司。

1.3 赣南脐橙热水处理试验设计

考虑赣南脐橙个体大小、质地均与现有报道[11-12]应用热处理的水果有差异，为获得合适的赣南脐橙热水处理温度和时间条件，设置温度和时间2个因素多个水平的试验(表1)。综合考虑本试验涉及的因素、水平及回归系数估计的可靠性，采用U*10(108) 拟水平表[16]，形成本试验的热水处理试验方案。

表1 因素水平表

1.4 试验方法

1.4.1 赣南脐橙热水处理方法

选取大小均匀，表面完好，无伤口的6个赣南脐橙为1个处理组，呼吸速率、硬度及可溶性固形物测定试验重复3次。于预热好的循环水浴锅内，脐橙上施泡沫及重物按压，使其浸没在热水中，并不断来回推动泡沫以使脐橙均匀受热。以温度指示进行计时，热水处理后的赣南脐橙立即置碎冰上冷却10 min，晾干赣南脐橙表面水分，分别用于赣南脐橙呼吸速率、硬度、可溶性固形物含量3个指标的测定。

1.4.2 赣南脐橙呼吸速率的测定

取热水处理后的一组赣南脐橙，分别称量其质量并记录，果蔬呼吸测定仪测定呼吸速率，记录5 min内呼吸室CO2的摩尔浓度变化值，测定时的检测室内温度t(℃)。以室温下未经热处理的赣南脐橙的呼吸速率测定结果作对照。呼吸速率计算公式：

(1)

式中：R，赣南脐橙的呼吸速率，mgCO2/(kg·h)；ΔCO2，5 min内CO2摩尔浓度变化量，μmol/mol；V，果蔬呼吸测定仪容器内自由体积，L；M，CO2的摩尔质量，g/mol；m，赣南脐橙的质量，kg；V0，测定温度下CO2的摩尔体积，L/mol。

1.4.3 赣南脐橙硬度的测定

果实去皮，果实硬度计测定赣南脐橙硬度，即在同一赣南脐橙的颈部，腰部，尾部测量3个数据，取其平均值作为该赣南脐橙的硬度值，以室温下未经热处理的赣南脐橙的硬度测定结果作为对照。

1.4.4 赣南脐橙可溶性固形物含量的测定

以手持式折光仪测定赣南脐橙可溶性固形物含量(soluble solid content，SSC)，以室温下未经热处理的赣南脐橙的可溶性固形物为对照。

1.4.5 热水处理后赣南脐橙的贮藏保鲜试验

取6个赣南脐橙为1组按1.4.1法进行热水处理，晾干赣南脐橙表面的水分，单个赣南脐橙套上PE保鲜袋(d=0.04 mm)，置于25 ℃的培养箱内保温20 d ，逐日观察并记录果实发病情况，每组热处理试验重复4次。对照组为相同数量的赣南脐橙，以2%次氯酸钠溶液浸泡赣南脐橙10 min，然后以无菌水(自来水敞盖煮沸、晾凉)冲洗后自然晾干，同样套上PE保鲜袋，置于25 ℃的培养箱内保温20 d ，逐日观察并记录果实发病情况。

1.4.6 热水处理后病原菌孢子死亡率的测定

选取健康赣南脐橙，清洗干净，用2%次氯酸钠进行表面消毒处理。取消毒后的赣南脐橙果皮，用无菌模具将赣南脐橙的果皮切成直径为3 mm的圆片(厚度约2 mm)，取20片果皮加入10 mL霉菌孢子悬液(孢子浓度为n×106个/mL，n<10)试管中，试管于50 ℃，5 min水浴后，碎冰中冷却至室温，采用平板菌落计数法测定热水处理后霉菌孢子的死亡率，设置不添加赣南脐橙皮同样热水处理的霉菌孢子悬液对照组，同样采用平板菌落计数法检测其死亡率，试验重复3次。

1.4.7 热水处理后病原菌孢子的荧光染色

对霉菌孢子悬液加赣南脐橙皮进行热水处理，参考宋爱环等[17]的原生质体制备方法对霉菌孢子去壁：渗透压稳定剂配制5 mg/mL的蜗牛酶，50～60 r/min，33 ℃振荡保温3.0 h。 去壁后的霉菌孢子以渗透保护剂洗涤2次，收集原生质体(105～106个细胞/mL)悬浮于1 mL再生培养基中，按照Hoechst33342/PI双染试剂盒说明书进行染色后置于荧光显微镜下观察。Hoechst 33342用氪激光激发的紫外光，激发波长为352 nm，发射波长为400～500 nm，产生蓝色荧光；PI用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为488 nm，发射光波波长大于630 nm，产生红色荧光。

1.5 数据分析

数据为重复试验的平均值和标准差，采用 IBM SPSS 20 数据处理软件进行回归分析和方差分析。

2 结果与分析

2.1 热水处理后赣南脐橙贮藏品质相关指标的直观分析

不同条件热水处理，对赣南脐橙贮藏品质相关指标的影响结果见表2。所有热水处理组赣南脐橙的呼吸速率均高于对照组，与对照组相比，差异极显著。相同处理温度下，热水处理时间长的，赣南脐橙呼吸速率数值增加明显。经热水处理后，赣南脐橙可溶性固形物含量均比对照组的可溶性固形物含量略微升高；而硬度则有所下降(除50 ℃，14 min组)。除55 ℃，17 min及60 ℃和65 ℃处理组的赣南脐橙表皮均有明显的灼伤外，45 ℃，14 min和50 ℃，5 min处理组的可溶性固形物与对照组相比，差异不显著；45 ℃，11 min和45 ℃，14 min处理组的硬度与对照组相比，差异不显著。

表2 热水处理后赣南脐橙贮藏品质相关指标测定结果

注：小写字母代表是在0.05水平下比较，不同字母间为差异显著；大写字母代表在0.01水平下比较，不同字母间为差异极显著。

2.2 热水处理后赣南脐橙贮藏品质相关指标的回归分析

根据均匀设计试验所得热水处理赣南脐橙的10组数据，采用逐个引进法进行二次多项式逐步回归，得到呼吸速率y与热处理温度x1和热处理时间x2的回归方程：

y=-19.32 + 0.12x12+0.06x1x2

(2)

回归方程偏回归系数的检验结果(表3)表明，温度x1和温度与时间的交互作用x1×x2对热水处理赣南脐橙的呼吸速率y有显著的影响，且rx1×x2>rx1×x1，tx1×x2>tx1×x1，说明温度与时间的交互作用比变量温度对方程的贡献更大。

表3 回归方程偏回归系数的检验结果

注：临界值：r0.01(7)=0.798，t0.01(7)=3.449。

以呼吸速率极小值法对热水处理温度时间条件进行寻优分析，得到最低指标值的因素组合为：热处理温度x1=45 ℃，时间x2=5 min，呼吸速率的最小值y=30.30 mgCO2/(kg·h)。

进一步对表2中赣南脐橙热水处理后的可溶性固形物含量和硬度指标分别对热处理温度和时间进行回归分析，发现回归方程在统计学上不显著。

2.3 热水处理后赣南脐橙的贮藏试验结果

为缩短试验周期，将热水处理与未进行热处理的赣南脐橙保藏于25 ℃温箱中保温20 d，比较各组赣南脐橙的发病情况。热水处理组与对照组发病症状基本一致，符合青、绿霉病害的典型特征，起初橙皮表面形成褐色水渍斑，2～3 d后长出白色菌丝，4～5 d即长出青绿色霉层，6～7 d全果腐烂。这说明青、绿霉病害是赣南脐橙采后贮藏的主要霉菌病害。

试验结果发现，不同热水处理组赣南脐橙的发病情况不同，详见表4。其中，55 ℃ 8 min处理组，赣南脐橙表皮虽未见明显灼伤，但有轻度脱水，这可能是其被侵染的主要原因。45 ℃，14 min，50 ℃，5min和50 ℃，14 min处理的3组脐橙均未发病。

表4 不同处理组赣南脐橙的发病情况

注：—，代表该组赣南脐橙已全部发病。

2.4 热水处理对病原菌孢子致死机制分析

2.4.1 热水处理对病原菌孢子死亡率的影响

为探究赣南橙皮对病原菌孢子死亡率的影响，将病原菌孢子悬液加入一定量的赣南脐橙皮进行热处理，以未加赣南脐橙皮热处理的霉菌孢子为对照组。试验选择45 ℃两组、50 ℃两组及55 ℃(8 min)共5组热水处理条件，测定热水处理后意大利青霉和指状青霉孢子的死亡率。试验结果见表5，试验组病原菌孢子死亡率明显高于对照组，差异极显著(P<0.01)。说明赣南脐橙皮可协同增强热水处理致死霉菌孢子。该结果与前期研究赣南脐橙皮与热同时处理可明显降低柑橘霉菌致病力结果相符[18]。

表5 不同热水处理病原菌孢子的死亡率 单位：%

注：大写字母代表在0.01水平下比较，不同字母间为差异极显著；意大利青霉与指状青霉孢子死亡率的显著性比较分别标注。

2.4.2 热水处理致病原菌孢子细胞膜的影响

采用试验设计中综合指标较优的热水处理方案50 ℃，5min，对热耐受性好的意大利青霉热水处理后制成的原生质体进行Hoechst 33342/PI荧光双染色。未加赣南脐橙皮热处理的病原菌，其原生质体中大多细胞呈蓝色荧光(图1-A，黑白图中亮度高者发蓝色荧光,)，表明大多霉菌孢子热水处理后的细胞膜仍完整；加了赣南脐橙皮热水处理的病原菌原生质体，大多细胞呈红色荧光(图1-B，黑白图中亮度高者发红色荧光)，说明试验组大多霉菌孢子热水处理后细胞膜遭破坏，因而使PI荧光染料通过破损的细胞膜进入胞内与核物质结合，呈红色荧光。前期的研究发现加赣南脐橙皮热水处理的柑橘霉菌悬液上清的电导率值和OD260nm值明显升高[18]，说明霉菌孢子细胞内容物溢出。本试验结果进一步说明加赣南脐橙皮热水处理杀死柑橘霉菌孢子的机制可能主要是破坏了霉菌孢子的细胞膜完整性。

图1 霉菌孢子荧光染色结果Fig.1 The results of fluorescence staining of mould spores

3 结论

(1)赣南脐橙采后热法保鲜效果

相比正交试验，均匀设计不仅可以大大减少试验点，用较少的试验获得较多的信息；并可以通过数据的回归分析，研究各因素变化与指标值之间的关系。试验得到呼吸速率y与热处理温度x1和热处理时间x2的回归方程：y=-19.32 + 0.12x12+0.06x1x2，且温度与时间的交互作用比变量温度对方程的贡献更大。

虽然根据回归分析，推断出的赣南脐橙最优热水处理条件为45 ℃ 5 min，但是本试验涉及的45 ℃，11 min处理组的赣南脐橙在温箱保藏过程中有赣南脐橙被侵染发病，且该条件下处理的两种病原菌孢子的死亡率也较低，综合分析热水处理对赣南脐橙贮藏品质相关3个指标的影响、赣南脐橙贮藏发霉情况及对病原霉菌孢子致死作用的影响，判断热水处理试验条件为50 ℃，5 min用于赣南脐橙采后热水处理保鲜具有可行性。

(2)赣南脐橙采后热水处理保鲜的机制

病原菌孢子热水处理试验证实，加入赣南脐橙皮热水处理的病原菌孢子死亡率明显高于对照组，这可能是由于赣南脐橙皮释放的柠檬烯、柠檬醛等抑菌成分起到了协同杀菌作用[19-20]。进一步荧光染色试验证实了加赣南脐橙皮热水处理的霉菌孢子细胞膜遭受了更为明显的破坏，从而导致霉菌孢子的死亡。

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Research of the preservation effect on postharvest Gannan navel orange by hot water treatment

LIN Li-ping1,2, YE Ming-e1, CHEN Yu-long3, ZHANG Feng-ying1, WU Guo-ping1*

1 (Key Lab for Agricultural Products Processing and Quality Control of Nanchang City, Nanchang 330045, China)2(Collaborative Innovation Center of Post-harvest Key Technology and Quality Safety of Fruits andegetables in Jiangxi Province，Nanchang 330045, China) 3(Sericulture and Agri-food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510610, China)

In order to study the feasibility of hot water treatment technology applied to citrus fruits postharvest preservation, two factors (temperature and time) and five level uniform experiments were carried out to study the effect of different heat treatment on the storage quality, mildew during the storing at room temperature, and the lethal effect on spores suspension ofPenicilliumitalicumandPenicilliumdigitatum. The results showed that the optimum hot water treatment conditions of Gannan navel orange was 50 ℃, 5 min. Under this heat treatment conditions, the respiration rate of navel orange was the lowest of 42.89 mgCO2/(kg·h); no mildew during 20 days storage period at room temperature; pathogenic spore suspension was treated by heat and peel of Gannan navel orange. The results suggested that Gannan navel orange peel composition and hot water had combinative inhibiting and killing effect on pathogenic spores, better than the control group. Moreover，pathogenic spore cell membrane was damaged obviously showing with Hoechst 33342/PI fluorescence double staining. The conclusion is that hot water treatment (50 ℃, 5 min) was feasible to preserve postharvest Gannan navel orange.

Gannan navel orange; hot water treatment; preservation effect; pathogenic fungi

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701042

硕士研究生(吴国平副教授为通讯作者,E-mail：jdwgp@163.com)。

江西省教育厅青年基金项目(GJJ14315)；广东省农业科学院农业部功能食品重点实验室开放基金项目(201351)；江西农业大学大学生创新创业训练计划项目(DC201336)

2016-05-25，改回日期：2016-07-02