老年晚期恶性梗阻性黄疸患者小肠黏膜中黏蛋白-2表达变化及不同疗法的效果

刘晓刚 程大铭 王利兵

(唐山市工人医院肝胆外科，河北 唐山 063000)

·消化、呼吸系统疾病·

老年晚期恶性梗阻性黄疸患者小肠黏膜中黏蛋白-2表达变化及不同疗法的效果

刘晓刚 程大铭 王利兵

(唐山市工人医院肝胆外科，河北 唐山 063000)

目的 探讨老年晚期恶性梗阻性黄疸患者小肠黏膜中黏蛋白-2表达变化及3种姑息疗法的效果分析。方法 恶性胆管梗阻患者88例，分为恶性胆管梗阻伴黄疸组56例，恶性胆管梗阻无黄疸组32例；另收集同期行胃镜检查的健康老年人30例为正常对照组。每位受试者在逆行胰胆管造影或胃镜检查时钳取8块肠黏膜组织，分别行HE染色，在透射电镜下观察肠黏膜超微结构改变，AB-PAS染色，免疫组化染色检测黏蛋白-2表达情况。根据治疗方法不同将恶性胆管梗阻伴黄疸患者分为采取Roux-en-Y吻合术(胆肠吻合组)、ERCP并胆管支架置入术(ERCP组)、PTCD组，观察治疗前后患者肝功能、体能、并发症情况。结果 HE染色显示，恶性胆管梗阻伴黄疸组患者肠黏膜绒毛完整性部分破损。电镜下观察恶性胆管梗阻伴黄疸组患者肠黏膜微绒毛变短、稀释、排列不齐，杯状细胞经复合胞吐释放出大量黏蛋白。AB-PAS染色显示，恶性胆管梗阻伴黄疸组患者肠杯状细胞数明显少于恶性胆管梗阻无黄疸组和健康对照组(P<0.05)；恶性胆管梗阻无黄疸组与健康对照组之间无统计学差异(P>0.05)。免疫组化染色显示，恶性胆管梗阻伴黄疸组患者黏膜-蛋白2阳性细胞表达水平明显低于恶性胆管梗阻无黄疸组和健康对照组(P<0.05)；恶性胆管梗阻无黄疸组与健康对照组之间无统计学差异(P>0.05)。术后7 d 3组患者总胆红素(TBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、γ-谷氨酰转移酶(GT)均明显低于术前(P<0.05)；3组间TBIL、ALT、γ-GT水平无统计学差异(P>0.05)。胆肠吻合组住院时间明显长于ERCP组和PTCD组(P<0.05)。ERCP组术后并发症发生率明显低于PTCD组和胆肠吻合组，PTCD组明显低于胆肠吻合组(P<0.05)。结论 梗阻性黄疸患者小肠黏膜黏蛋白-2数量明显减少，是导致肠黏膜屏障损伤的主要机制之一；杯状细胞可通过复合胞吐释放大量黏蛋白-2修复受损的黏液层，维持屏障功能。老年晚期恶性梗阻性黄疸患者行ERCP 胆道支架治疗在保证疗效基础上可有效降低并发症发生率，缩短住院时间。

恶性梗阻性黄疸；小肠黏膜；黏蛋白-2

梗阻性黄疸是临床常见的胆系疾病，其主要病理机制为肠黏膜屏障功能受损，引发肠源性内毒素血症。黏蛋白-2是一种糖基化分泌型黏蛋白，主要由杯状细胞经胞吐作用分泌，是防御肠道致病菌及内源性有害物质侵入的天然屏障〔1〕。动物实验已证实，黏蛋白-2参与维持肠黏膜屏障〔2〕；但关于梗阻性黄疸患者肠黏膜黏蛋白-2表达变化的研究十分少见。恶性梗阻性黄疸多因转移性癌侵犯胆总管引发胆管狭窄〔3〕，老年晚期恶性梗阻性黄疸患者由于机体器官功能衰退，免疫系统反应性差，死亡率很高；且多数患者确诊时已失去根治术机会，需行姑息性治疗减轻黄疸症状，改善肝功能〔3〕。本次研究通过检测老年晚期恶性梗阻性黄疸患者小肠黏膜形态学和黏蛋白-2表达的变化情况，进一步分析其在肠黏膜屏障损失中的作用；同时比较三种姑息治疗方法的疗效。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年6月至2016年4月本院收治的恶性胆管梗阻患者88例，入选标准：①年龄≥60岁，术前经影像学检查或穿刺病理活检诊断为恶性胆管梗阻；②术前评估无行根治手术机会；③患者自愿参与本次研究，签署知情同意书。根据是否伴有黄疸分为恶性胆管梗阻伴黄疸组56例，男36例，女20例；年龄60～89〔平均(72.69±10.34)〕岁，血清总胆红素(TBIL)49.10～455 μmol/L；恶性胆管梗阻无黄疸组32例，男20例，女12例；年龄60～87〔平均(72.38±9.55)〕岁，血清TBIL 7.9～18.40 μmol/L。另收集同期行胃镜检查的健康老年人30例为正常对照组，男18例，女12例，年龄60～83〔平均(70.42±5.13)〕岁，血清TBIL 5.9～18.0 μmol/L。三组性别构成、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 主要试剂和仪器 兔抗人黏蛋白-2抗体(美国hyclone-pierce公司)；SP9001试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂(北京欣兴唐生物科技有限公司)；AB-PAS染色液(北京雷根生物技术有限公司)；石蜡切片机(德国SLEE)；H-9500透射电子显微镜(天美科学仪器有限公司)；生物组织自动包埋机(湖北泰维科技实业有限公司)。

1.3 取材及检测 每位受试者在逆行胰胆管造影或胃镜检查时，在十二指肠乳头瘤体病变下方2～5 cm范围(健康者在十二指肠乳头下方2～5 cm)内钳取8块肠黏膜组织。10%甲醛溶液固定后，常规石蜡包埋，4 μm连续切片。①取其中2块组织行HE染色，观察肠黏膜的形态学改变和病理学评分。②2块在电子显微镜下观察肠黏膜超微形态改变和肠内杯状细胞变化。③2块行AB-PAS染色观察：将切片常规脱蜡至水，阿尔辛蓝染色30 min，蒸馏水冲洗3 min，1%高碘酸染色20 min，蒸馏水冲洗3次，AB-PAS染色20 min，蒸馏水冲洗3 min，脱水、透明；中性树胶封片。④2块行免疫组化检测黏蛋白-2分布和表达情况：石蜡切片脱蜡至水，水浴抗原修复后磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，加3%过氧化氢，孵育15 min，加山羊血清封闭特异性抗体，孵育30 min，滤纸吸干多余血清，加一抗(1∶1 000稀释)，PBS代替一抗作阴性对照，4℃冷藏过夜；加生物素标记的二抗，湿盒内孵育30 min，加辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉卵白素，二胺基联苯胺(DAB)显色后显微镜下观察终止反应，脱水、透明，中性树脂封片。

1.4 结果判断 光学显微镜下观察HE染色形态学改变，采用Chiu氏评分评定小肠黏膜损伤程度。采用Image-Pro Plus 分析软件，相同放大倍数下对图像进行分析，计数5个视野，进行AB-PAS染色阳性细胞的平均光密度值分析。免疫组化染色呈棕黄色为阳性，每个患者取3张切片，每张切片随机取5个视野，以阳性细胞染色OD值表示抗原表达。

1.5 治疗方法 恶性胆管梗阻伴黄疸患者行胆管空肠Roux-en-Y吻合术(胆肠吻合组)16例，离断远端空肠，梗阻近端行胆管空肠端吻合，近、远端空肠行端侧吻合。经内镜逆行胰胆管造影(ERCP)并胆管支架置入术(ERCP组)29例，先行ERCP，明确梗阻病灶情况后插入导丝，选择合适尺寸的胆道支架，循导丝置入后释放，X线透视下确定放入位置和释放情况，内镜下观察引流情况。经皮肝穿刺胆道引流(PTCD)组11例，以超声探查结果和肝内胆管扩展情况选取穿刺点，患者取侧卧位，常规消毒、局麻后，18 G针穿刺，到靶点后取出针芯，放入引导丝到肝内扩张胆管。将PTCD引流管置入后拔出引导丝，连接引流袋。术后均给予抗炎、保肝、止血治疗，内引流者给予抗胰腺炎治疗；观察治疗前后肝功能、体能、并发症情况。

1.6 统计学分析 应用SPSS19.0软件，计量资料进行t检验，计数资料进行χ2检验。

2 结 果

2.1 组织形态学观察和肠黏膜损伤评估 恶性胆管梗阻伴黄疸组患者肠黏膜绒毛完整性部分破损，表现为绒毛顶端间隙变大，两侧存在分离且部分绒毛顶端上皮破坏；恶性胆管梗阻无黄疸组和健康对照组患者肠黏膜绒毛完整性较好，呈指状突起，上皮细胞排列紧密。Chiu氏评分：恶性胆管梗阻伴黄疸组为3.65±1.16，明显高于恶性胆管梗阻无黄疸组和健康对照组的1.24±0.46、1.20±0.69(P<0.05)，无黄疸组与健康对照组之间无统计学差异(P>0.05)。见图1。

A 恶性胆管梗阻伴黄疸组；B恶性胆管梗阻无黄疸组；C 健康对照组；下图同图1 各组肠道黏膜的组织学形态(HE染色，×100)

2.2 肠黏膜超微结构改变 电镜下观察恶性胆管梗阻伴黄疸组患者肠黏膜微绒毛变短、稀释、排列不齐，杯状细胞经复合胞吐释放出大量黏蛋白；恶性胆管梗阻无黄疸组和健康对照组患者肠黏膜杯状细胞饱满，微绒毛排列整齐，排秘活动不明显。见图2。

图2 各组肠黏膜超微结构(×20 000)

2.3 AB-PAS染色情况 恶性胆管梗阻伴黄疸组患者肠杯状细胞形态不规则，部分向肠腔内部分泌大量黏蛋白；恶性胆管梗阻无黄疸组和健康对照组患者肠杯状细胞饱满且均匀分布于肠黏膜上皮，呈紫红色。恶性胆管梗阻伴黄疸组患者肠杯状细胞数OD值为0.16±0.04，明显少于恶性胆管梗阻无黄疸组和健康对照组的0.33±0.05、0.36±0.04(P<0.05)；恶性胆管梗阻无黄疸组与健康对照组之间无统计学差异(P>0.05)。见图3。

图3 各组肠黏膜AB-PAS染色(×400)

2.4 黏蛋白-2免疫组化染色情况 恶性胆管梗阻伴黄疸组患者肠黏膜-2蛋白阳性细胞表达OD值为0.19±0.04，明显低于恶性胆管梗阻无黄疸组和健康对照组的0.37±0.09、0.35±0.06(P<0.05)；恶性胆管梗阻无黄疸组与健康对照组之间无统计学差异(P>0.05)。见图4。

2.5 恶性胆管梗阻伴黄疸患者术后恢复情况 三组患者术后黄疸、皮肤瘙痒等症状逐渐消失或减轻，体能得到改善。术后7 d后3组患者TBIL、ALT、γ-GT均明显低于术前(P<0.05)；3组间TBIL、ALT、γ-GT水平无统计学差异(P>0.05)。见表1。

图4 各组黏蛋白-2免疫组化染色(×400)

组别nTBIL(μmol/L)术前术后7dALT(U/L)术前术后7dγ-GT(U/L)术前术后7d胆肠吻合组16349.51±65.37210.51±60.301)238.71±38.06126.25±19.631)446.31±115.64220.91±70.641)ERCP组29390.26±69.50218.46±51.491)253.16±58.33135.68±45.811)523.18±102.58261.48±62.131)PTCD组11416.13±64.19226.69±39.581)188.20±42.1699.31±24.731)460.73±96.34211.29±65.391)

与术前相比：1)P<0.05

2.6 恶性胆管梗阻伴黄疸患者住院时间 胆肠吻合组住院时间(14.31±6.48)d，明显长于ERCP组(6.03±2.69)d和PTCD组(6.95±3.18)d(P<0.05)；ERCP组与PTCD组之间无统计学差异(P>0.05)。

2.7 恶性胆管梗阻伴黄疸患者术后并发症 胆肠吻合组16例患者中切口感染1例、消化道出血1例、胆管炎2例，并发症发生率为25.00%；ERCP组29例患者中急性胰腺炎1例，消化道出血1例，均经保守治疗后好转，并发症发生率为6.89%；PTCD组11例患者中术后感染1例、脱管1例，并发症发生率为18.18%。ERCP组术后并发症发生率明显低于PTCD组和胆肠吻合组，PTCD组明显低于胆肠吻合组(P<0.05)。

3 讨 论

梗阻性黄疸肠黏膜通透性增加可引起细菌和内毒素易位，引发多器官损伤和败血症，但分子学机制仍未明确。肠黏膜屏障由肠黏液层、上皮细胞和其间隙相连的机械屏障及免疫系统组成，可阻止肠道中有害物质通过肠黏膜进入血液循环和组织器官〔4〕。黏蛋白家族中黏蛋白-2是肠黏液层的主要成分。动物实验显示，黏蛋白-2参与维持小鼠肠黏膜层，被轮状病毒感染的小鼠黏蛋白-2 mRNA表达量明显增加，以提升抗病毒能力〔5〕。同时黏蛋白-2数量或功能降低还可能参与先天性巨结肠、肠易激综合征等疾病的发生、发展〔6〕。本次研究中恶性胆管梗阻伴黄疸患者存在肠黏膜屏障损伤，而肠道黏液层黏蛋白-2低表达可能是肠黏膜屏障功能损伤的重要因素。

梗阻性黄疸患者也常伴有肠黏膜屏障受损，但该类患者肠黏膜黏蛋白-2变化的相关研究鲜有报道。本次研究提示恶性胆管梗阻性黄疸可损伤黏蛋白-2，影响黏膜屏障，刺激杯状细胞分泌大量黏蛋白-2以修复受损的黏液层，是小肠自我保护机制之一。

杯状细胞是一种在肠道广泛分布的单细胞分泌腺，主要分泌黏蛋白、TFF1等物质，在肠黏膜屏障中具有重要作用〔7〕。当黏膜受损时，杯状细胞可通过变形、迁移进行修复。本次研究显示，恶性胆管梗阻性黄疸组杯状细胞发挥复合胞吐作业，分泌黏蛋白修复黏液层，维持屏障功能，但会降低杯状细胞内的黏蛋白储存量，肠黏膜储备防御功能降低，导致适应性保护下降，再次受到外源性刺激时，杯状细胞难以及时分泌出足够的黏蛋白。

晚期恶性梗阻性黄疸患者因受肿瘤生物特性和内脏解剖结构的限制，多数患者确诊时已失去根治术机会。因此需行姑息性治疗减轻黄疸症状，改善肝功能。目前临床中主流的姑息治疗方法包括Roux-en-Y吻合术、ERCP、PTCD。本次研究中比较了三种疗法对老年晚期恶性梗阻性黄疸患者的治疗效果，结果显示，三种术式均能有效减除胆道梗阻，减轻黄疸并在较长时间内维持通畅，在减黄和生存时间上无明显差异。但ERCP胆道支架治疗的并发症发生率明显低于Roux-en-Y吻合术和PTCD，术后住院时间明显短于Roux-en-Y吻合术，有效减轻患者痛苦和治疗费用。

1 Li TF,Ren KW,Han XW,etal.Percutaneous transhepatic cholangiobiopsy to determine the pathological cause of anastomotic stenosis after cholangiojejunostomy for malignant obstructive jaundice〔J〕.Clin Radiol,2014;69(1):13-7.

2 Beyazit Y,Kekilli M,Ibis M,etal.Can red cell distribution width help to discriminate benign from malignant biliary obstruction? A retrospective single center analysis〔J〕.Hepatogastroenterology,2012;59(117):1469-73.

3 Tsauo J,Li X,Li H,etal.Transjugular insertion of bare-metal biliary stent for the treatment of distal malignant obstructive jaundice complicated by coagulopathy〔J〕.Cardiovasc Interv Radiol,2013;36(2):521-5.

4 Liang C,Mao H,Wang Q,etal.Diagnostic performance of magnetic resonance cholangiopancreatography in malignant obstructive jaundice〔J〕.Cell Biochem Biophys,2011;61(2):383-8.

5 Junejo MA,Siriwardena AK,Parker MJ,etal.Peripheral oxygen extraction in patients with malignant obstructive jaundice〔J〕.Anaesthesia,2014;69(1):32-6.

6 Qiu YD,Bai JL,Xu FG,etal.Effect of preoperative biliary drainage on malignant obstructive jaundice:A meta-analysis〔J〕.World J Gastroenterol,2011;17(3):391-6.

7 Yilmaz B,Parildar Z,Bozkaya H,etal.Prognostic utility of serum neopterin in obstructive jaundice secondary to malignant lesions treated by percutaneous transhepatic biliary drainage〔J〕.J Vasc Int Radiol;24(6):865-72.

〔2016-06-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

河北省卫生厅青年科技课题(20140810)

刘晓刚(1966-)，男，硕士，教授，主要从事肝胆疾病的诊疗研究。

R57

A

1005-9202(2017)01-0129-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.057