小鼠肝切除使红细胞内血红蛋白的电泳释放增强

韩丽红 ，闫斌 ，高丽君 ，苏燕 ，杨文杰 ，秦文斌

1.包头医学院生物化学教研室，内蒙古包头 014060；2.包头医学院第一附属医院普外二科，内蒙古包头 014010

肝脏对人体的重要性众所周知。关于肝病时红细胞(red blood cell,RBC)和血红蛋白（hemoglobin ，Hb）变化的研究表明，肝脏病变会造成红细胞系统异常，出现不同程度的贫血现象。肝脏是造血的主要器官，以生成红细胞为主，那么肝切除时红细胞会怎样，笼统来说，肯定有变化，但查不到这方面的文献报道。包头医学院血红蛋白研究室长期从事红细胞电泳释放血红蛋白的研究[1-6]，该文中利用这种技术研究了小鼠肝切除后红细胞释放血红蛋白的情况，取2016年12月—2017年4月于包头医学院生物化学与分子生物学实验室行小鼠肝切除术后0～7、14 d的血红细胞做血红蛋白释放电泳，与未做手术小鼠及假手术组的小鼠的血红蛋白释放试验进行对比，每组3～5只小鼠，观察其多带释放情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物的来源

C57小鼠，SPF级，雄性，体重20～25 g。由军事医学科学院动物部提供。小鼠称重后4%水合氯醛(0.01 mL/g)腹腔注射麻醉小鼠，仰卧固定其四肢于手术板上。常规切口处剃毛备皮。碘伏消毒，无菌纱布覆盖，取剑突至耻骨上方腹部正中切口逐层入腹。按Higgins等经典方法，于腹部正中做切口，挤出肝脏左叶和中叶于肝蒂部结扎后切除，关闭腹腔，按层缝合切口。肝部分切除手术均在上午进行，严格按照无菌手术操作，术后保温并自由进食及饮水。

1.2 实验方法

用小鼠的全血或分离得到的红细胞做淀粉-琼脂糖凝胶电泳。先普泳，电势梯度6 V/cm，泳2 h，停电15 min。前进再释放即电势梯度6 V/cm，再通电30 min。后退再释放即电势梯度 6 V/cm，倒正负极再通电15 min。电泳后先染丽春红染液过夜，取出、照相、晾干。再染联苯胺染液，加3%过氧化氢直到血红蛋白变成蓝黑颜色，转入漂洗液漂洗两次，5 min/次，取出晾干。

2 结果

2.1 第一批肝切除后小鼠红细胞的单向多带再释放电泳结果

由图1可以看出这一批标本中假手术标本再释放明显弱于肝切除1 d者，肝切除14 d标本出现梯带增强。

图1 第一批肝切除后小鼠红细胞的单向多带再释放电泳结果

2.2 第二批肝切除后小鼠红细胞的单向多带再释放电泳结果

由图2可以看出，这一批标本中，与未切除标本比较，肝切除1、3、4 d标本都显示出梯带增强。

图2 第二批肝切除后小鼠红细胞的单向多带再释放电泳结果

2.3 肝切除后6 h与14 d小鼠红细胞的双向多带再释放电泳结果

由图3可以看出，肝切除后电泳释放出来的多带是与主要带（箭头↑所指处）相平行，说明它们是来自再释放[7-9]。另外，14 d小鼠红细胞的多带再释放明显大于6 h者，支持单向电泳时的结果。

图3 肝切除后6 h与14天小鼠红细胞的双向多带再释放电泳结果

2.4 小鼠肝切除后标本的综合结果

由此可以看出全部小鼠肝切除实验结果，它来自五批标本，综合起来包括了肝切除实验的全部过程0～7 d。从综合结果来看，未做手术和做过假手术的标本再释放强度较低，其他肝切除后不同时间标本的再释放强度几乎都明显提高，个别结果偏低可能与标本量太少有关。

图4 小鼠肝切除后标本的综合结果

3 讨论

红细胞内血红蛋白释放试验 （hemoglobin releasing test，HRT）是将红细胞加在淀粉-琼脂糖混合凝胶中进行电泳，一次通电完成电泳，此时有 Hb释放出来，称为“初释放”；在电泳释放过程中进行“断电-再通电”，又会有Hb从原点释放出来，称为“再释放”。正常情况下，初释放时，红细胞内的大部分 Hb都释放出来，残留较少；再释放时，残留Hb再次离开红细胞，出现新的Hb区带。关于人类疾病与血红蛋白释放关系进行了一系列研究[8-10]。HRT是该研究室提出的一种实验方法,用来观察各种条件下红细胞释放血红蛋白的情况。释放的动力是电泳,这是共同因素,不同释放结果则取决于红细胞以及其与血浆环境之间的相互作用。

该研究室研究过人类肝硬化时血红蛋白释放的变化，发现肝硬化患者的血红蛋白的再释放增强[9]。共筛查了38例全血标本的HRT，利用等低渗全程试验和双层对角线电泳技术，比较了肝硬化患者和肝功正常血液标本的 HRT，发现肝硬化患者标本的“前进”和“后退”再释放都增强。选取电泳效果最明显的等低渗标本做对角线电泳，可以看到 Hb后退成分，说明了肝硬化患者红细胞中 Hb的存在状态异常，前进再释放释放很多Hb后，后退再释放又释放出较多Hb。因此，得出结论肝功异常会影响到红细胞膜上成分，这一点早有研究，但肝再生时红细胞内血红蛋白的电泳释放情况尚无人研究，该文从血红蛋白电泳释放角度研讨红细胞内的变化。

肝脏有很强的再生能力，小鼠肝部分切除术后大约两周肝脏既可以完成再生。研究发现，肝部分切除后肝再生的过程中，小鼠红细胞血红蛋白释放试验发生了改变，未做手术和做过假手术的标本再释放强度较低，其它肝切除后不同时间标本的再释放强度几乎都明显提高，个别结果偏低可能与标本量太少有关。肝脏再生的过程中，肝功能受到一定影响，红细胞的血红蛋白也发生了改变。血红蛋白释放实验增强，今后的研究可以从血清化验指标入手，进行进一步研究。

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[1]韩丽红,杨文杰,高丽君,等.血红蛋白F与血红蛋白A2之间的交叉互作[J].中国医药指南,2015,13(5):62-63.

[2]韩丽红,闫斌,高丽君,等.肿瘤患者红细胞的血红蛋白释放实验初步研究[J].中国医药指南,2015,13(8):12-13.

[3]乔姝,高丽君,宝勿仁必力格,等.ABO血型的双向全程释放电泳图谱[J].包头医学院学报,2016,32(7):5-7.

[4]Caili Wang,Liping Liu,Lihong Han,et al.The effect of plasma components on hemoglobin release test in red blood cells (RBC)[J].Toxicological&Environmental Chemistry,2017,99(3):448-459.

[5]Yan Su,Lisha Han a,Lijun Gao,et al.Abnormal increased re-released Hb from RBCs of an intrahepatic bile duct car cinoma patient was detected by electrophoresis release test[J].Bio-Medical Materials and Engineering,2015,26:S2049-S2054.

[6]Yaqiong Gao,Lijun Gao,Jianmin Ren,et al.The clinical significance of different re-released electrophoresis types in RBC suspension and whole blood[J].Journal of Residuals Science&Technology,2016,13(5):2841-2849.

[7]秦文斌.活体红细胞内血红蛋白的电泳释放[J].中国科学生命科学,2011,41（8）：597-607.

[8]Su Yan,Jing Shen,Lijun Gao,et al.Molecular interaction of released proteins in electrophoesis of human erythrocytes[J].Electrophoresis,2012,33:1042-1045.

[9]宝勿仁必力格,王翠峰.肝硬化患者血红蛋白释放试验明显异常[J].临床和实验医学杂志,2011,10（24）：1915-1917.

[10]Yan Su,Lijun Gao,Wenbin Qin.Interactions of hemogl obin in lived red blood cells measured by the electrophoesis release test[J].Protein Electrophoresis Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,2012,869:393-402.