微囊化转VEGF基因成肌细胞在全厚皮片移植中的动物实验研究

高崧瀛 ，孙健 ，黄巍 ，王鑫 ,李冰 ，单静 ,孙洋 ，王锋 ，汤维波

1.黑龙江省医院整形颌面外科，黑龙江哈尔滨 150036；2.哈尔滨医科大学附属第四医院体检中心，黑龙江哈尔滨 150001；3.黑龙江省医院血管外科，黑龙江哈尔滨 150036;4.黑龙江省医院手术室，黑龙江哈尔滨 150036;5.黑龙江省医院麻醉科，黑龙江哈尔滨 150036;6.黑龙江省医院泌尿外科，黑龙江哈尔滨 150036

CHANG在1964年首次提出人工细胞的概念，此后诸多学者在医学领域实验研究。目前，微囊化技术在医学领域已广泛应用。微囊化技术具有免疫隔离作用对细胞内的细胞，可由微囊外营养物质提供营养，同时较大颗粒的免疫成分不会对微囊内的细胞等进行吞噬及其它免疫排斥。整形外科皮肤移植是最常见的操作之一，全厚皮片具有耐磨性、颜色接近正常皮肤、弹性好，治疗疤痕挛缩及面部、手部皮肤缺损等效果较为理想等多方面优点，但其较中厚、刃厚皮片成活率低，存在部分坏死风险较高不易为患者所接受，临床应用受到限制[1-4]。

全厚皮片移植的成活，除与手术因素有关，受区的营养状态及细胞因子的活性也有一定关系。VEGF是一种细胞因子，其对血管增殖、再生等有良好的促进作用，但VEGF在体内降解快，直接注射成本高，效果差。通过微囊化技术的免疫隔离，可使VEGF在一定时期内持续分泌，促进全厚皮片成活，由于微囊化细胞周围纤维化、囊内氧和营养不足等原因微囊化细胞逐渐死亡，作用消失，不会对机体产生远期未知影响。通过实验研究，如能明显提高全厚皮片移植的成活率，可进一步应用于临床。因此，该研究以2016年1月购自吉林大学实验动物中心健康Wistar大鼠50只为研究对象，对比研究微囊化转VEGF基因成肌细胞对提高大鼠全厚皮片移植成活率的影响，为进一步的临床应用提供理论及实践依据。

1 材料及方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂 转VEGF基因成肌细胞 （哈医大四院实验中心冻存）、海藻酸盐（Sigma公司）、氯化钡（天津市科密欧化学试剂有限公司）、免疫组化检测抗体（第VIII抗体）（美国DAKO公司）

1.1.2 主要仪器 DYY-5型稳压稳流电泳仪、SHZ-88A恒温振荡器、全自动凝胶图像分析系统、小型台式离心机、TGL-16M冷冻离心机、电子天平、医用型洁净工作台、恒温培养箱、CO2孵箱、微囊发生器、倒置显微镜及成像系统。

1.1.3 手术器械及药品 常规外科手术器械、敷料及巾单，1.0%戊巴比妥，75%医用酒精，0.25%碘伏，生理盐水。Wistar大鼠，50只，2016年1月购于吉林大学实验动物中心，雌雄不限，清洁级。体重250～300 g。

1.2 方法

（1）将冻存的转VEGF基因成肌细胞进行解冻、复苏。加入有血清DMEM，放入37℃细胞培养箱中培养，并进行传代、扩增。（2）微囊化过程将1 g海藻酸钠加入到100 mL MilliQ水中，涡旋使部分海藻酸盐溶解，然后将该溶液置于旋转器上过夜。将无菌氯化钡溶于无菌MilliQ水中，终浓度为30 mmol/L。使用前超净台紫外线灭菌30 min；准备好用于微囊化的C2C12成肌细胞。对于成肌细胞，先用胰酶消化，然后转移入一50 mL falcon试管中，500 rpm离心5 min，然后弃上清。以20 mL 0.9%NaCl重悬沉淀，500 rpm离心5 min，然后弃上清。重复上述步骤。以一个连有16G套管的1 mL注射器测量细胞沉淀的体积。用套管的尖将每100 μL 1%海藻酸盐混合均匀。安装微囊发生器和注射器，使用前高温灭菌。使针尖距离沉淀培养皿20 cm。调整氧气压力至100 kpa，调节氧气流量为8 L/min。将海藻酸钠/细胞悬液装入1 mL注射器中（装入0.8 mL）。注意不要融入气泡。将注射器装在微囊发生器上，打开注射器驱动器，将海藻酸钠/细胞悬液推入到微囊发生器中。用还有30 mL BaCl2的培养皿盛接微囊，放置2 min。收集微囊到含有20 mL生理盐水的50 mL falcon试管中。500rpm离心3 min，弃上清。重复2遍。以含有DMEM的培养瓶悬浮微囊化细胞，在37℃/5%CO2孵箱中培养。（3）大鼠全厚皮片动物模型的构建 以双侧髂棘连线为起始处，以背部中线为长轴标记为4.0 cm×4.0 cm的范围，作为皮片移植区。动物采用清洁级Wistar大鼠，重量250～300 g，雌雄不限。2016年1月购自吉林大学实验动物中心，实验动物在标准动物房内饲养，标准饮食。（4）实验动物分组 实验动物总计50只，随机化将其分为微囊化组和对照组。微囊化组按标记范围切取制备全厚皮片，在切取皮片后的创面上，给予多点注射转VEGF基因成肌细胞混悬液，每点0.1 mL，纵横间隔呈点阵样，间隔均为1.0 cm。然后将切取的全厚皮片原位回植，打包包扎，放回笼中单笼饲养。对照组给予相应位置等量生理盐水注射，其他操作及步骤与微囊化组相同。（5）观察指标 ①植皮成活面积观察：植皮操作14 d后给予拆除打包包扎，观察植皮成活情况，并摄影记录。②大鼠植皮组织局部外源性VEGF检测：取1 g大鼠移植皮肤，提取VEGF总蛋白。因该实验所用的成肌细胞已转染携带6his-tag，故通过镍柱纯化得到外源性VEGF蛋白，进行Western blot特异性目的蛋白检测（western blot所用抗体由美国Pierce公司提供，操作方法按说明书进行），PVDF膜洗涤显色后，固定，晾干。应用扫描仪扫描得到结果。③单位面积血管计数：在微囊组和对照组，各随机选取10只大鼠，于植皮区域随机切取0.5 cm×0.5 cm面积，10%甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，在10倍光镜下计数12各视野下血管断面数，并计算每平方厘米的微血管数。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 微囊观察

微囊近球形，大小较均匀，微囊之间无粘连。随机选取10个微囊，测得平均直径（75±15）μm。包裹细胞数目较恒定，平均20个/微囊，培养24 h后，观察数目无明显变化。

2.2 全厚皮片移植存活结果

应用Image pro 5.0软件对两组植皮成活面积进行测算，然后SPSS 15.0统计学软件进行分析，结果显示，微囊化组成活面积（14.1±0.61）cm2，对照组成活面积（13.5±0.55）cm2，微囊化组成活面积百分比（88.0±3.6）%，对照组成活面积百分比（84.5±3.5）%。微囊化组植皮成活面积百分比明显高于对照组，两组间差异有统计学意义（t=3.42，P＜0.01），见表 1。

表1 两组中成活面积及百分比比较

表1 两组中成活面积及百分比比较

组别 平均成活面积 （cm2） 成活面积百分比（%）微囊化组（n=25）对照组（n=25）t P 14.1±0.61 13.5±0.55 3.42＜0.01 88.0±3.6 84.5±3.5 4.65＜0.01

2.3 血管计数结果

微囊化组与对照组中，随机切取的皮肤进行微血管计算比较，微囊化组较对照组的微血管计数高，差异有统计学意义（P＜0.01）。 见表 2。

表2 两组中微血管计数比较[，cm2]

表2 两组中微血管计数比较[，cm2]

组别平均微血管数微囊化组（n=10）对照组（n=10）t P 25.8±3.99 20.6±5.46 2.43＜0.05

2.4 外源性VEGF蛋白检测结果

通过镍柱纯化得到pcDNA6/HisA-VEGF(外源性VEGF蛋白)表达的Western blotting结果显示微囊化组有外源性VEGF蛋白表达，对照组没有检测到外源性蛋白表达。

3 讨论

全厚皮片移植是整形外科较为常见的治疗手段之一。它被广泛用于各种皮肤缺损的修复，如面部各种创伤（如外伤或烧伤）、肿瘤切除后等遗留的创面，重要功能部位的皮肤缺损等。植皮作为整形外科的基本治疗技术，有着非常多的优点，如操作简单，不需要吻合血管等复杂操作，全厚皮片移植成活后耐磨性好，皮肤颜色、弹性、质地较好，不存在供区知名血管、肌肉、神经损伤等风险，且植皮可选择隐蔽部位作为供区，不受受区皮肤条件的限制。但全厚皮片移植的存活常不理想，除与术中临床操作有一定关系，最主要因素为全厚皮片所需营养较刃厚、薄中厚皮片多，新生的毛细血管不足，不能及时长入，影响其成活。刃厚或薄中厚皮片虽较易成活，但耐磨性、易挛缩、恢复后皮肤颜色多为花斑样等，常不能为理想的修复方法，局部皮瓣虽能弥补刃厚或薄中厚皮片的缺点，但常存在供区皮肤量不足等情况，应用也受到限制。丁菲菲等[5]对56例患者进行面部皮肤移植治疗，其中全厚皮片15例，1例成活不佳，中厚皮片38例，全部成活。丁菲菲等又对142例患者，157只手部瘢痕挛缩的患者进行皮肤移植，其中115只手采用全厚皮片移植，2只手厚中厚皮片移植，40只手中厚皮片移植，全厚皮片中5例完全成活，75例基本成活，33例成活不佳，2例完全坏死；而中厚皮片移植中2例完全成活，34例成活良好，4只基本成活。此数据表明，中厚皮片较全厚皮片更易成活。全厚皮片动物模型的报道不多，该研究采用大鼠背部构建全厚皮片移植主要因为前期曾进行大鼠缺血皮瓣的实验研究，大鼠皮下组织疏松，切取全厚皮片操作简单，设计4.0 cm×4.0 cm的皮瓣对大鼠来说，属较大面积植皮，更具说服力。因没有类似的大鼠全厚皮片移植结果作为对比，故采用对照研究，以获得较为客观的数据。该实验应用微囊化组和对照组各25只大鼠，全厚皮片成活面积显示，微囊化组成活面积高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），与文献资料记载临床观察相符合。

VEGF作为一种内皮细胞的特异性有丝分裂原，也是一种有效的血管形成和血管通透性诱导因子。VEGF具有促进血管内皮细胞增殖和迁移、诱导毛细血管管腔形成的作用。理论上可能有促进移植组织成活的作用。VEGF、bFGF等生长因子在皮片、皮瓣移植方面应用的动物实验研究也常见报道，但通过局部皮内或皮下注射给药方式并不理想，因VEGF体内半衰期仅6 min，通常不及扩散就被降解消失，连续给药会加重局部的组织损伤，所以，我们提出微囊化注射的方法，能解决上述的不足。转VEGF基因成肌细胞能持续分泌VEGF，但在体内由于排斥反应很快被免疫系统破坏。已有实验研究证实，微囊化与否对转VEGF基因成肌细胞分泌VEGF蛋白过程没有显著影响[6]。李保国等[7]也对微囊化间充质干细胞活力检测方法进行比较，目前已有较多手段对微囊化细胞活力进行检测。曾进行微囊化转VEGF基因成肌细胞治疗大鼠缺血皮瓣的研究，获得较理想的效果，对该实验进行全厚游离皮片移植也是一个启示和佐证[8]。该次在微囊化组及对照组中，随机各切取了10个标本进行微血管计数检测，结果显示，微囊化组微血管数高于对照组，且差异有统计学意义（P＜0.05）。再一次证实了VEGF的作用。微囊化细胞由于周围纤维细胞增生，使氧气和营养物质供给阻断，最终微囊化细胞坏死，这是至今仍未解决的问题[9]。目前的研究结果，人工细胞还不能达到生命体那样自我复制、自我修复、自我进化[10]。但这些对全厚皮片移植没有任何影响，相反地，排除了微囊化细胞持续分泌VEGF，有诱发肿瘤的潜在风险[11]，是一种较为安全的方法。

综上所述，经该实验证实，微囊化转VEGF基因成肌细胞在全厚皮片移植受区创面多点注射，能显著提高全厚皮片移植的成活率。通过进一步实验及临床研究，将此方法早日应用于临床，为整形外科和烧伤科医生提供多一种理想的选择方法。

（

）

[1]慕森，李仔儒，杜晓明.全厚皮片移植在面部皮肤缺损修复中的应用[J].临床皮肤科杂志，2014,43(4):255-256.

[2]慕森，赵春燕，高成贵，等.全厚皮片移植修复皮肤缺损34例[J].中华皮肤科杂志，2015，48(6):431-432.

[3]郝永红，许明火，高全文，等.全厚皮片移植修复手部瘢痕挛缩畸形[J].中国美容医学，2015,24(8):14-15.

[4]孙天骏，焱福.微囊化基因工程细胞的研究进展[C].中华医学会烧伤外科学分会2011年学术年会论文汇编,2012.

[5]丁菲菲，林源，蒙诚跃，等.手指瘢痕挛缩屈曲严重畸形的矫形治疗[J].中华损伤与杂志,2015,10(1):30-32.

[6]高崧瀛，刘长松，黄巍.微囊化对转VEGF基因成肌细胞血管内皮生长因子分泌的实验研究[J].黑龙江医学,2012,36(6):417-419.

[7]李保国，刘荣，佀国宁.微囊化间充质干细胞活力检测方法比较[J].上海理工大学学报,2016,38(6):594-597.

[8]Weihua Chen,Daping Yang,Peng Wang，et al.Microencapsulated Myoblasts Transduced by the Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)Gene for the Ischemic Skin Flap[J].Aesthetic Plastic Surgery,2011,35(3):326-332.

[9]王贯乔，朱海，刘尧娟，等.微囊化胰岛细胞移植在抗纤维增生方面的相关研究[J].实用器官移植电子杂志,2016,4(6):341-344.

[10]刘巍，李培森，李可，等.人工细胞制备的研究进展[J].天津工业大学学报,2016,35(5):11-19.

[11]李玉灵，赵华，任秀宝.VEGF及其受体与免疫抑制细胞关系的研究进展[J].山东医药,2016,56(17):105-107.