Cav1.2钙离子通道三维结构的同源建模及其应用

雷 明, 苏敬阳, 李 卓, 晏 珊, 孙雪菲, 朱 彤, 郝丽英

(1.中国医科大学药学院药物毒理教研室，辽宁 沈阳 110122；2. 东北大学环境生物学教研室，辽宁 沈阳 110004)

Cav1.2钙离子通道三维结构的同源建模及其应用

雷 明1, 苏敬阳1, 李 卓1, 晏 珊1, 孙雪菲1, 朱 彤2, 郝丽英1

(1.中国医科大学药学院药物毒理教研室，辽宁 沈阳 110122；2. 东北大学环境生物学教研室，辽宁 沈阳 110004)

目的 构建心肌Cav1.2钙离子通道三维结构模型，检验模型的准确性与可靠性。方法 利用SWISS-MODEL同源建模服务器，对豚鼠心肌细胞Cav1.2通道α1亚基进行同源建模，建模结果提交至加州大学蛋白质结构在线检测服务器进行检测评估，并对结构模型进行打分。利用MOE软件分子对接程序模拟阻断剂或药物与Cav1.2通道模型的结合，进一步验证通道模型的准确性与可靠性。结果 在SWISS-MODEL服务器上搜寻到的模板序列Cav1.1 α1S与目标序列Cav1.2 α1C均为L型钙通道，序列比对结果显示其同源性高达71.5%，选择自动模式(automated mode)进行同源建模。L型钙通道阻断剂维拉帕米、硝苯地平、地尔硫卓能结合到Cav1.2通道三维结构模型的特定区域，而钠通道特异性阻断剂河豚毒素并未与该模型相结合，中药有效成份白花前胡甲素和小檗碱与该模型也有一定的结合。结论 成功构建了心肌Cav1.2钙离子通道三维结构模型，为后续研究提供了可靠样本，也为同源建模在研究离子通道三维结构预测中的应用奠定了基础。

离子通道；三维结构；同源建模；MOE软件；L型钙通道阻断剂；分子对接

蛋白质是生命活动的主要承担者，一切生命活动都与蛋白质密切相关，蛋白质的生物学功能很大程度上取决于蛋白质的分子结构。基因组数据测序的巨大进步，使我们目前已经知道的蛋白质序列以数百万计，但实验所解析的蛋白质结构数目相对很小。尽管解析蛋白质结构的技术已经取得了非常重大的进展，但解析蛋白质结构依然是一个劳动密集型和花费昂贵的过程，蛋白质空间结构的测定速度还远远赶不上蛋白质序列增长的速度，并且随着基因组测序的进行，两者差距有越来越大的趋势。因此，用计算机进行蛋白质结构和动力学的理论预测成了目前了解蛋白质结构信息的一种有效手段，可了解药物的作用、代谢和信号转导通路在活细胞中的分子基础，进而可在生命科学和材料科学领域设计新的技术[1-3]。目前，蛋白质空间结构预测的方法有3种，即从头预测法(ab initio prediction)、同源建模法(homology modeling)和折叠识别法(fold recognition)。其中同源建模法也称为比较建模法(comparative modeling)，是基于知识的蛋白质结构预测方法，是目前蛋白质结构预测方法中最简单、最为成熟的方法[4-5]。根据对PDB数据库中的蛋白质结构比较研究得知，任何一对蛋白质，只要序列长度达到一定程度，序列相似性超过30%，则具有相似的三维结构。因此，对于一个未知结构的蛋白质，如果能找到一个已知结构的同源蛋白质，就能以该蛋白质的结构为模板，为未知结构的蛋白质建立三维结构模型。同源建模通常包括下列主要步骤：模板搜寻、序列对比、结构保守区寻找、目标模型构建、结果优化评估等。

L-型钙通道(L-type Ca2+channel，LTCC) 是电压依赖性钙通道(voltage-dependent Ca2+channel，VDCC)中的一种[6]，也称为二氢吡啶受体，是研究最为广泛的高电压依赖型钙通道，存在于大多数可兴奋细胞膜上，如骨骼肌、心脏、脑、内分泌细胞、神经元及其他组织，其中Cav1.1主要表达于骨骼肌中，Cav1.2主要表达于心肌和平滑肌中。在心肌细胞中，Cav1.2钙通道介导的钙离子内流触发肌浆网钙释放通道ryanodine受体(RYR)开放，肌浆网存储的钙离子大量释放，这种级联效应称为“钙致钙释放”(Ca-induced Ca2+release，CICR)，在心脏的兴奋收缩偶联(excitation-contraction couple，EC)中起着关键性作用[7]。L型钙通道是由α1、β、α2/δ、γ等多个亚基组成的高分子跨膜蛋白复合物，分子量约400kD。其中α1是主要亚基，负责运输钙离子，分子量约170～140 ku，由4个同源结构域组成(Ⅰ～Ⅳ)，每个结构域包含6个跨膜片断(S1～S6)，位于S4上的带正电荷的精氨酸和赖氨酸残基具有电压感受器的作用，膜电位的变化可以引起氨基酸残基位置的改变，控制通道的开放或关闭。S5和S6之间的P环构成通道的核心，决定通道对钙离子的选择性[8]。其他亚基不参与钙离子运输，但对通道的电压感受、电生理特征以及细胞定位等有重要的调控作用，因此也被称为辅助性亚基。

蛋白质的三维结构是其发挥功能的基础，目前对L型钙通道一级结构即氨基酸序列的研究已较为完善，但对其三维结构的研究结果还不多。对蛋白质三维结构研究的实验方法主要有两种，X射线晶体学(X-ray crystallography，XRC)和核磁共振(nuclear magnetic resonance,，NMR)，由于高纯度L型钙通道蛋白的制备和结晶较为困难，所以很难得到完整的通道蛋白三维结构。最近，清华大学医学院颜宁教授研究组利用高分辨率冷冻的电子显微镜，获得了完整的Cav1.1通道的三维结构[9]。我们以此结构为模板，采用同源建模的方法构建了Cav1.2通道的三维模型，并用于相关离子通道药物作用的研究。

1 材料与方法

1.1 Cav1.2通道的同源建模 利用SWISS-MODEL同源建模服务器(http://swissmodel.expasy.org)对豚鼠心肌细胞Cav1.2通道α1亚基(NP_001166394.1)进行同源建模，具体方法步骤如下：输入目标序列，搜寻合适模板；L型钙通道三维结构研究的实验结果较少，只找到一个合适的模板(PDB:3jbr)，与目标序列同源性较高，可以使用自动模式(Automated Mode)进行建模。

1.2 建模结果评估 利用加州大学蛋白质结构在线检测服务器(The Structure Analysis and Verification Server，SAVS，http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/)进行建模结果评估，该服务器提供多种蛋白质结构检测工具，并对结构模型进行打分。

1.3 模拟阻断剂或药物与通道模型的结合 利用MOE软件(Molecular Operating Environment)分子对接程序模拟阻断剂或药物与Cav1.2通道模型的结合，进一步验证通道模型的准确性与合理性，实验选用的药物包括L型钙通道阻断剂维拉帕米、硝苯地平、地尔硫卓，钠通道特异性剂河豚毒素，以及作用于钙通道的中药有效成分白花前胡甲素和小檗碱。

2 结果

2.1 Cav1.2通道三维结构模型 L型钙通道三维结构研究的实验结果较少，在SWISS-MODEL同源建模服务器只找到一个合适的模板(PDB:3jbr)，该结构为L型钙通道α1S亚基(Cav1.1 α1S)，与目标序列(Cav1.2 α1C)同源性高达71.5%，序列对比如Fig 1所示。

采用SWISS-MODEL同源建模服务器自动模式进行目标序列(Cav1.2 α1C)建模，Fig 2所示为钙通道三维结构示意图，其中A为Cav1.1 α1S(PDB:3jbr)，B为利用SWISS-MODEL同源模拟得到的Cav1.2 α1C。由于实验条件的原因，该结构中只含跨膜蛋白片断，不含膜两侧的N末端、C不端以及部分LOOP区域。

2.2 Cav1.2通道三维结构模型的检测评估 将同源建模得到的三维结构模型提交到加州大学蛋白质结构在线检测服务器(The Structure Analysis and Verification Server，SAVS，http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/)进行建模结果检测，根据打分结果(overall quality factor)进行评估。Overall quality factor值越高越好，一般高解析度的晶体结构该值可以达到95，而对于解析度一般的来说该值只能到91左右。本实验中同源建模得到的三维结构模型Cav1.2 α1C Overall quality factor值为61.749，相对较低，这与模板蛋白的晶体结构解析度有关，将模板蛋白结构((Cav1.1 α1S，PDB:3jbr)提交到服务器进行检测，该值为66.801。Overall quality factor值还可能与蛋白质的大小有关，本实验中钙通道蛋白的三维结构模型相对较大，有1 000多个氨基酸，在另一实验中我们用相同的方法对只有100多个氨基酸的钙调蛋白(calmodulin，CaM)进行同源建模，将得到的三维结构模型提交至该服务器检测，Overall quality factor值高达97.778。

Fig 1 Alignment of target sequence and template sequence

Fig 2 3D structure L-type Ca2+ channel

A:Structure of Cav1.1 α1S(from PDB:3jbr)；B:Structure of Cav1.2 α1C(homology modeling with SWISS-MODEL server)

2.3 阻断剂或药物与通道模型的结合 Fig 3所示为L型钙通道阻断剂与Cav1.2通道三维结构模型的结合，其中A、B、C分别为维拉帕米、硝苯地平、地尔硫卓与Cav1.2通道结合的三维结构模拟图，D、E、F分别为维拉帕米、硝苯地平、地尔硫卓与Cav1.2通道结合的二维平面示意图。从Fig 3A、3D中可以看出，维拉帕米与Cav1.2通道结合起主要作用的氨基酸主要包括Gln1215、Arg1376、Thr1377、Trp1380、Ala1637、Glu1641，大多位于Cav1.2通道第四结构域。从Fig 3B、3E中可以看出，硝苯地平与Cav1.2通道结合起主要作用的氨基酸主要包括Lys369、His370、Glu710、Met711、Met746，大多位于Cav1.2通道第二结构域。从Fig 3C、3F中可以看出，地尔硫卓与Cav1.2通道结合起主要作用的氨基酸主要包括Val1245、Glu1251、Lys1298、Asn1313、Lys1367、Arg1371，全部位于Cav1.2通道第四结构域。由此可见，这几种L型钙通道阻断剂都能结合到Cav1.2通道三维结构模型的特定区域，以钠通道特异性阻断剂河豚毒素作为阴性对照，并未发现其与该模型有结合，与Cav1.2通道特性一致，证明该模型准确可靠。

Fig 3 Binding of L-type Ca2+ channel blocker to 3D structure model of Cav1.2 channel

A～C,3D structure of L-type Ca2+channel blocker binding to Cav1.2 channel, pink compound represent Verapamil, Nifedipine and Diltiazem, respectively；D～F, Schematic diagram of L-type Ca2+channel blocker interact with specific amino acids

早期研究发现中药有效成份白花前胡甲素和小檗碱对对豚鼠心肌细胞钙电流有影响[10-11]，于是我们将这两种化合物与Cav1.2通道三维结构模型模拟结合，如Fig 4A、C所示，白花前胡甲素与Cav1.2通道结合起主要作用的氨基酸主要包括Lys1234、Asn1246、Glu1251、Trp1312、Ser1370、Arg1371、Trp1530、Glu1536、Val1644，大多位于Cav1.2通道第四结构域。如Fig 4B、D所示，小檗碱与Cav1.2通道结合起主要作用的氨基酸主要包括Glu1251、Lys1367、Ser1370、Arg1371、Trp1530、Asp1534、Val1644，大多位于Cav1.2通道第四结构域。由此说明，白花前胡甲素和小檗碱都与Cav1.2通道有一定的结合，然后发挥其药理作用。

Fig 4 Binding of active ingredient of traditional Chinese drug to 3D structure model of Cav1.2 channel

A～B:3D structure of active ingredient of traditional Chinese drug binding to Cav1.2 channel, green compound represent Praeruptorin A and Berberine, respectively；C～D:Schematic diagram of active ingredient of traditional Chinese drug interact with specific amino acids

3 讨论

蛋白质同源建模技术逐渐成为一个较为常规的蛋白质结构分析方法，目前互联网上提供了很多利用同源建模技术预测蛋白质结构的服务器，比如SDSC1(San Diego)、3D-JIGSAW(London)、FAMS(Tokyo)和SWISS-MODEL(Geneva)。其中SWISS-MODEL是瑞士日内瓦生物医学研究所(The Geneva Biomedical Research Institute )于1993年建立发展起来的分子建模服务系统(Molecular Modeling Server)，采用一系列工作软件，从经典的布鲁克海文蛋白质结构数据库(Brookhaven PDB)中提取蛋白质查询序列的模拟结构信息，用具有蛋白质相似性的已知结构蛋白建立的未知结构蛋白的分子模型，是迄今为止应用最广泛的免费服务之一[12-13]。本实验在SWISS-MODEL服务器上搜寻到的模板序列Cav1.1 α1S与目标序列Cav1.2 α1C均为L型钙通道，序列比对结果显示其同源性高达71.5%，完全适用于Cav1.2钙离子通道三维结构的同源建模。将同源建模得到的三维结构模型提交到加州大学蛋白质结构在线检测服务器(The Structure Analysis and Verification Server，SAVS)进行建模结果检测，虽然打分结果(Overall quality factor)分值较低，但这主要是由于模板蛋白的结构以及氨基酸数目较大，并不影响Cav1.2离子通道三维结构模型的准确性和可靠性。

维拉帕米、硝苯地平、地尔硫卓都是经典的L型钙通道阻断剂，而钠通道特异性剂河豚毒素并不作用于L型钙通道，分子对接结果显示这几种L型钙通道阻断剂都能结合到Cav1.2通道三维结构模型的特定区域，而钠通道特异性阻断剂河豚毒素并未与该模型有结合，与Cav1.2通道特性一致，证明该模型准确可靠。同时，中药有效成份白花前胡甲素和小檗碱与Cav1.2通道三维结构模型也有一定的结合，进一步证明该模型准确性和可靠性。除钙通道外，其他离子通道如钠离子通道、钾离子通道、瞬时感受器电位离子通道也在各种生理病理过程发挥着重要作用[14-16]，运用同源建模的方法同样有助于进一步研究其作用机制。

总之，本实验从Cav1.2钙离子通道蛋白质氨基酸序列出发，以Cav1.1钙离子通道三维结构为模板，通过同源建模的方法得到了该离子通道的空间结构，同时对所构建的结构模型合理性进行了评估与分析，所得到的结构为后续研究提供了可靠样本，也为同源建模在研究离子通道三维结构预测的应用奠定了基础。

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Homology modeling and application of 3D structure of Cav1.2 channel

LEI Ming1, SU Jing-yang1, LI Zhuo1, YAN Shan1, SUN Xue-fei1, ZHU Tong2, HAO Li-ying1

(1.DeptofPharmaceuticalToxicology,SchoolofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China; 2.LabofEnvironmentBiologyandEngineering,NortheasternUniversity,Shenyang110004,China)

Aim To construct 3D structure model of cardiac Cav1.2 channel and check its accuracy and reliability.Methods Homology model of Cav1.2 channel α1 subunit was constructed using SWISS-MODEL server. The model was submitted to an online testing server built by University of California and scored by it. The binding of Cav1.2 channel with blocker or drug was simulated by MOE software molecular docking program to check the model′s accuracy and reliability.Results Both the target sequence Cav1.2 α1C and the template sequence Cav1.1 α1S searched by SWISS-MODEL server belonged to L-type Ca2+channel. Since the homology was 71.5% revealed by sequence alignment, homology modeling was performed using automated mode. L-type Ca2+channel blockers Verapamil, Nifedipine and Diltiazem could bind to the 3D structure model of Cav1.2 channel, while sodium channel blocker TTX could not. Furthermore, active ingredient of traditional Chinese drug Praeruptorin A and Berberine could also bind to the 3D structure model of Cav1.2 channel.Conclusion The 3D structure model of Cav1.2 channel was constructed successfully, which provides reliable materials for further studies and establishes the foundation for the application of homology modeling in the study of 3D structure prediction of ion channels.

ion channels；3D structure；homology modeling；MOE software；L-type calcium channel blocker；molecular docking

时间：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.032.html

2016-08-22，

2016-11-29

国家自然科学基金资助项目(No 31471091)

雷 明(1984-)，男，博士生，研究方向：离子通道药理学，E-mail:leimingcqu@163.com; 郝丽英(1965-)，女，博士，教授，博士生导师，研究方向：心血管药理学与离子通道药理学，通讯作者，E-mail:lyhao@mail.cmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.016

A

1001-1978(2016)01-0090-05

R322.11；R329.25；R341；R348.1；R977.6