慢性阻塞性肺疾病大鼠模型骨骼肌组织氧化应激损伤的研究

罗勇 潘俊 程意 韩锋锋



慢性阻塞性肺疾病大鼠模型骨骼肌组织氧化应激损伤的研究

罗勇1，2潘俊2程意2韩锋锋2

目的 研究不同烟熏强度对SD大鼠骨骼肌组织氧化应激损伤，探讨慢性阻塞性肺疾病骨骼肌功能障碍的机制。方法 40只SD大鼠随机分为对照组、实验1组、实验2组、实验3组，每组各10只。实验1组、实验2组、实验3组分别给予4周、12周、20周的烟熏制作慢性阻塞性肺疾病动物模型，烟熏结束后肺组织制作病理标本观察其变化，并取大鼠双侧伸趾长肌，用ELISA方法检测各组大鼠的伸趾长肌组织匀浆丙二醛(MDA)的浓度、伸趾长肌组织蛋白质提取液羰基化蛋白(PC)的浓度、伸趾长肌组织DNA中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量。 结果 光镜下大鼠肺组织随着烟熏强度的增加，其肺组织炎性细胞浸润、肺泡壁破坏相应更为显著。与对照组相比，实验2组、实验3组MDA、8-OHdG显著增高(P<0.05-P<0.01)，实验3组PC显著增高(P<0.05)。 结论 烟熏不仅可导致大鼠肺组织炎症加重、肺泡结构破坏，还可导致其骨骼肌组织氧化应激损伤。

慢性阻塞性肺疾病；骨骼肌；氧化应激

慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是人类最常见的致残和致死性疾病，现为人类第4大死亡病因，该病主要机制是有害气体和有害颗粒刺激气道所产生的气道的慢性炎症，最终导致气流受限。目前发现慢阻肺除了明显的呼吸道症状之外，还往往伴有全身的症状，其中骨骼肌功能障碍近年来受到极大关注，慢阻肺骨骼肌功能障碍不仅影响患者的活动能力、生活质量，而且影响患者的预后[1-2]。有研究发现慢阻肺患者的股四头肌功能明显受损，并与肺功能分级相关，肺功能I级、Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级的慢阻肺患者，其股四头肌功能障碍的发生率分别为76.5%、95.2%、95.7%、100%[3]。本文通过烟熏法制作慢阻肺大鼠模型，并检测不同烟熏强度的慢阻肺大鼠伸趾长肌的氧化应激损伤的变化，探讨慢阻肺骨骼肌功能障碍的机制。

资料与方法

一、 材料

6周龄的雄性清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠共40只，由上海交通大学医学院附新华医院实验动物中心提供，购自上海西普尔-必凯实验动物公司，生产许可证号：SCXK(沪)2003-0002，使用许可证号：SYXK(沪)2003-0031，体重约250g。

二、方法

1 分组与烟熏：采用随机原则分成4组，每组大鼠10只，分别为对照组、实验1组、实验2组、实验3组。实验组为大鼠烟熏组，分别暴露于不同剂量的香烟烟雾。每组大鼠总共饲养20周，从开始实验起除对照组正常饲养外，实验1组烟熏暴露强度为4周(为保持和其它试验组的可比性，先正常饲养16周，第17周起开始烟熏)、实验2组烟熏暴露强度为12周(先正常饲养至第9周起烟熏)、实验3组烟熏暴露强度为20周。每5只大鼠为一个单元饲养，饲养单元为35cm×40cm×50cm (容积70 L) 的有机透明玻璃箱，烟熏组大鼠每天暴露于10支大前门香烟(上海卷烟厂制造，每支含焦油量12mg，烟气烟碱量〔尼古丁〕0.9mg，一氧化碳14mg)，每次被动吸烟时间大于30分钟，一周六天。每天定时记录进食情况，每14天测量大鼠体重与身长。所有大鼠均给予普通饮食饲养，自由进水、进食。第21周用速眠新0.5mL-0.8mL腹腔注射麻醉，消毒后开胸在麻醉状态下经心脏抽血致死。

2 氧化应激损伤检测：处死大鼠15分钟内游离双侧伸趾长肌(Extensor digitorum longus，EDL)放入组织管液氮内冻存，统一用ELISA方法检测各组实验大鼠的EDL肌组织匀浆丙二醛(MDA)的浓度、EDL肌组织蛋白质提取液羰基化蛋白(PC)的浓度，以及EDL肌组织DNA中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量。把不同浓度的标准品和样品加入相应的孔中，37℃孵育2h后洗板。然后依次加入辣根过氧化物酶工作液、标准色液、终止液，用自动酶标仪处于30min内读取光密度值(OD)，根据标准曲线计算待测样品MDA、PC、8-OHdG的含量。

3 大鼠肺组织病理检查：处死大鼠后用10mL的等渗磷酸盐缓冲液注入右心室灌注肺，当红细胞被冲走后肺变成白色，取出肺组织，用4%中性福尔马林固定24h以上。按矢状面在中、外1/3处取材，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片。切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗、苏木素染色等处理，常规脱水，封片。处理后的标本放置放大200倍的显微镜下观察。

三、统计学处理

结 果

一、 大鼠肺组织形态学表现

对照组、实验1组、实验2组、实验3组四组大鼠肺组织病理学有明显的改变，随着烟熏强度的递增，大鼠肺部组织形态病理改变越趋明显。主要病理变化为肺泡毛细血管充血、肺泡间质炎症细胞浸润、支气管周围肺泡壁炎症细胞浸润、肺泡壁破坏、肺泡融合。(见图1-4)。

图1 对照组大鼠肺部组织病理(×200)，肺组织形态基本正常，部分区域血管扩张充血 图2 实验1组大鼠(烟熏4周)肺部组织病理(×200)，肺泡间质炎症细胞浸润，部分毛细血管充血 图3 实验2组大鼠(烟熏12周)肺部组织病理(×200)，支气管周围见炎症细胞浸润，支气管周围肺泡壁炎症细胞浸润，部分肺泡壁破坏融合 图4 实验3组大鼠(烟熏20周)肺部组织病理(×200)，支气管周围及肺泡间质见有大量炎症细胞浸润，部分肺泡融合，毛细血管充血

二、 大鼠骨骼肌组织氧化应激损伤检测

表1 不同烟熏强度与对照组大鼠 伸趾长肌氧化应激损伤的比较±s)

与对照组比较:▲P<0.05，▲▲P<0.01

与对照组相比，实验2组、实验3组MDA、8-OHdG显著增高(P<0.05-P<0.01)，实验3组PC显著增高(P<0.05)。

讨 论

氧化应激损伤是慢阻肺主要发病机制之一[4]。香烟烟雾是一种组成成分非常复杂的环境污染物，香烟烟雾中含有大量的活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)，每口香烟烟雾中大约有1017个氧自由基和4700种有害化学物质。卷烟烟雾中的自由基一般分为两类，即气相自由基和固相自由基。固相自由基的性质一般比较稳定，以醌类和半醌类、多环芳烃自由基为主。气相自由基非常活泼，以烷自由基和烷氧自由基为主。吸烟的焦油相和气相烟雾中存在的大量的自由基，它们可以直接或间接地攻击细胞成分，甚至杀伤细胞，导致各种疾病的发生。在各种由卷烟烟雾导致的疾病中，呼吸道疾病首当其冲，尤其是慢阻肺、支气管肺癌等疾病最受影响[5]。

尽管只有15%的吸烟者最终发展为慢阻肺，但在慢阻肺的患者中90%有吸烟史。因此，烟熏也是制作慢阻肺动物模型的方法之一。由于香烟烟雾的有害成份可以直接刺激气道，导致气道的异常炎症反应和氧化应激损伤，和慢阻肺的发病机制相似。本研究大鼠处死后肺组织标本制成的病理切片在镜下所见，对照组大鼠肺组织结构基本正常，而烟熏组光镜下见大鼠支气管黏膜及肺泡间质炎性细胞浸润，其中实验3组尤为明显，肺泡间质和支气管黏膜下可见大量炎性细胞浸润，并可见呼吸细支气管、肺泡管、肺泡囊扩大，形成小叶中央性肺气肿，许多肺泡破裂融合，毛细血管充血明显。而实验1组由于烟熏时间较短，其病理改变明显好于其它两组(见图1-4)。本研究通过烟熏导致大鼠气道和肺组织大量炎性细胞浸润、肺泡壁结构破坏，并且随着烟熏强度的增加(时间的延长)，肺组织炎症和肺组织破坏更趋严重，从大鼠病理形态的变化看本实验通过烟熏大鼠复制了慢阻肺动物模型。

氧化应激损伤是自由基介导损伤的主要形式。细胞绝大多数为膜性结构，不饱和脂肪酸在细胞膜上大量存在，是最容易受到ROS攻击的生物分子，它们极易产生过氧化作用。脂类过氧化反应产生脂过氧自由基(lipoperoxide radical, LOO.)。LOO.对另一个不饱和脂肪酸抽氢，引发连锁反应。生物膜中含有多种多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA) ，如花生四烯酸、油酸和亚油酸等。PUFA在ROS的作用下，可在不饱和双键上不断发生氧化作用。在这一过程中可以形成许多中间产物，如脂氧自由基(lipoxide radical, LO.)、氢过氧化脂(lipid hydroperoxide, LOOH)、LOO.等，这些中间继发产物都属于ROS。PUFA的过氧化作用常需要消耗大量的氧气，而最终产物之一是丙二醛(malondialdehyde, MDA)。因此，MDA是脂质过氧化的重要指标，也是组织氧化应激损伤的重要证据[5-6,8]。

本研究数据发现烟熏后大鼠气道炎性细胞浸润，气道发生异常炎症反应。不仅如此，与气道的远隔组织骨骼肌也存在脂质过氧化损伤，烟熏12周以上的大鼠骨骼肌组织MDA显著升高，而烟熏4周的大鼠骨骼肌组织MDA的浓度并未见明显增高，提示大鼠骨骼肌组织的脂质过氧化损伤与烟熏有一定的剂量依赖关系。有研究发现慢阻肺患者呼出气冷凝液中MDA明显升高，且与慢阻肺的严重程度相关[9]。我国有研究者也发现用持续5个月时间气管内滴注弹性蛋白酶制作肺气肿的动物模型，其腓肠肌中脂褐素(lipofusion)较对照组明显升高[10]。PUFA的过氧化作用常需要消耗大量的氧气，而其最终产物之一是MDA，它与蛋白质或核酸交联后可形成惰性的脂褐素，脂褐素正是自由基介导的蛋白质或脂质发生氧化后能激发出荧光的色素产物。该实验的数据与本实验的结果均提示吸烟(或针对气道的其它损害，如气道内滴注弹性蛋白酶)不仅造成局部呼吸道的损伤，对全身其它远隔系统和脏器(如骨骼肌组织)同样造成脂质过氧化损伤。

蛋白质是构成生物体的重要组成部分，是由多种氨基酸合成的肽链生物大分子。蛋白质和氨基酸都是容易被ROS攻击的靶分子，ROS可使蛋白质的肽链断裂， ROS还可使蛋白质的二级、三级和四级结构破坏，折叠减少，无规律卷曲增加。当蛋白质经受上述这些改变后其生物功能发生很大变化。由于蛋白质受到ROS攻击后必然生成羰基衍生物，蛋白质羰基化是指蛋白质氨基酸残基侧链中的氨基或亚氨基受到氧自由基攻击最后转变成醛基,并释放NH3的过程。蛋白质中的赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸残基都有可能参与羰基化。因此羰基是判断蛋白质是否被氧化的标志[11]。本实验的数据发现烟熏20周的大鼠骨骼肌组织的羰基化蛋白的含量明显上升，而12周的烟熏强度虽然使大鼠的气道出现显著的炎症反应，但大鼠骨骼肌组织的蛋白质氧化应激损伤尚不十分显著，大鼠骨骼肌发生氧化应激损伤明显存在与烟熏时间的相关性。我们以往的实验发现烟熏3个月的大鼠反映骨骼肌总蛋白降解率的酪氨酸以及反映骨骼肌肌纤维蛋白降解率的3-甲基组胺酸均明显高于对照组[12-13]。我们推断尽管烟熏3个月大鼠骨骼肌组织的蛋白质氧化应激损伤尚不十分明显，但烟熏大鼠骨骼肌组织蛋白已经开始分解加速，并发生发生骨骼肌的消耗和萎缩。

核酸尤其是DNA是生物体的重要成分，它带有生物遗传信息编码，能够控制多种生物功能，如蛋白质的合成和遗传性状等。ROS能使DNA的双链和(或)单链断裂，使DNA的碱基变成自由基，有ROS产生的DNA氧化损伤可以破坏核酸分子的完整性和构型，DNA 氧化的损伤将使细胞发生遗传性改变和功能变化，甚至造成细胞死亡和癌变。在DNA 氧化的损伤中鸟嘌呤是最易发生氧化损伤的碱基，鸟嘌呤氧化可发生在DNA 双链上，在自由基的攻击下以鸟嘌呤8位碳原子氧化后可形成8-OHdG，DNA链上8-OHdG 可以与胞嘧啶以外的其他碱基配对形成点突变，其中GC→TA 突变的发生已为大量研究所证实。在哺乳动物细胞中，相当数量的自发性突变与8-OHdG 有关。在各种氧化损伤中，以鸟嘌呤8位碳原子氧化后形成8-OHdG最为常见，因此8-OHdG也成为DNA损伤最普遍的标志物。作为DNA损伤的副产物，当有化学致癌物刺激时，会产生更多的8-OHdG。同样的情况也在RNA中发生，只不过是由鸟嘌呤8位碳原子氧化后形成8-羟基-鸟嘌呤，其也被作为RNA损伤的重要检测指标[14-15]。本实验的结果发现烟熏12周以上后立即处死的大鼠骨骼肌组织DNA中8-OHdG明显升高，而烟熏4周和对照组骨骼肌组织DNA中8-OhdG明显低于其它组，提示大鼠烟熏到一定强度后会造成骨骼肌组织的核酸氧化应激损伤。

慢阻肺患者往往伴有骨骼肌萎缩和功能障碍，导致骨骼肌肌力和耐力下降，直接影响着疾病的进展和预后，近年来慢阻肺患者的骨骼肌功能障碍引起了愈来愈多的学者的关注[1-3]。其分子生物学机制较为复杂，为多机制共同参与所致[17-18]。本研究对实验大鼠分别烟熏4-20周，目的是观察不同烟熏强度对大鼠骨骼肌组织氧化应激损伤的影响。香烟烟雾中含有大量的ROS，可以造成机体气道的氧化应激负荷加重，氧化应激是当生物体内ROS的生成与清除平衡状态被破坏后而导致ROS增加的过程，当各种因素打破这一平衡而导致ROS浓度超过生理限度时就会发生生物大分子损伤，造成靶细胞、靶组织甚至靶器官氧化应激损伤。已有研究发现慢阻肺的氧化应激负担加重是全身性的，并不仅仅只累及呼吸系统[19]。上述的研究证实香烟烟雾暴露至一定时间和强度后会导致大鼠气道发生异常炎症反应，这种反应同时也会导致远隔组织——骨骼肌组织的氧化应激负荷加重，包括骨骼肌组织的脂质、蛋白质和DNA/RNA的氧化损伤。

目前关于“慢阻肺是一种呼吸道疾病，同时又具有系统性表现，常合并体重下降、营养不良、骨骼肌功能障碍，而后者又是慢阻肺预后的重要因素”的观念已达成共识[20]。氧化应激是慢阻肺重要的发病机制之一，也已被广泛认同[5-6]。本研究的结果数据提示烟熏刺激可使骨骼肌组织发生氧化应激损伤，也间接提示慢阻肺患者的系统性表现与氧化应激负荷加重，并最终导致氧化应激损伤有关。

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Study on oxygen stress damage of skeletal muscle in chronic obstructive pulmonary disease model rats with different intensities of passive cigarette smoking

LUOYong,PANJun,CHENGYi,HANFeng-feng

DivisionofRespiratoryMedicine,XinhuaHospitalChongmingBranchAffiliatedtoMedicineSchoolofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai202150,China

Objective To study the oxygen stress damage of skeletal muscle in chronic obstructive pulmonary disease model rats with different intensities of passive cigarette smoking. Methods 40 rats were divided into 4 groups averagely: the control group, the trial 1 group, the trial 2 group and the trail 3 group. The trial 1, 2 and 3 groups were exposed to passive cigarette smoking for 4 weeks, 12 weeks and 20 weeks respectively. Lung tissue specimens were observed and MDA , PC and 8-OHdG in the extensor digitorum longus of rats were detected through ELISA. Results Inflammatory cells infiltration and alveolar rupture could be seen by light microscope in the lung tissue specimens of rats increasing proportionally to length of time of exposure to cigarette smoking. MDA, 8-OHdG in the trial 2, 3 groups and PC in the trial 3 group increased significantly while compared with the control group (P<0.05-P<0.01). Conclusion Cigarette smoking not only can cause inflammation in the lung and destruction of alveolar, but also result in oxygen stress damage in the distal skeletal muscle tissue.

chronic obstructive pulmonary disease; skeletal muscle; oxygen stress

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.02.017

上海市卫生和计划生育委员会资助课题(No 20134141)

1. 202150 上海，上海交通大学附属新华医院崇明分院呼吸科

2. 202150 上海，上海交通大学附属新华医院呼吸科

2016-06-27]