维生素D受体基因Apa1、Taq1多态性与肺鳞癌易感性的关系

杨雁鸿，吴剑冬，周文文，侯燕燕，尹端端，王真真

(1.河北省秦皇岛市第一医院肿瘤科，河北 秦皇岛 066000；2.承德医学院研究生院，河北 承德 067000)

维生素D受体基因Apa1、Taq1多态性与肺鳞癌易感性的关系

杨雁鸿1，吴剑冬1，周文文1，侯燕燕1，尹端端1，王真真2

(1.河北省秦皇岛市第一医院肿瘤科，河北 秦皇岛 066000；2.承德医学院研究生院，河北 承德 067000)

目的探讨维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)Apa1、Taq1两基因位点的多态性与肺鳞癌易感性之间的关系。方法采集288例肺鳞癌患者和284例健康对照个体肘静脉血5 mL，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技术方法，对VDR Apa1、Taq1两基因位点行基因型检测。 结果VDR Taq1位点基因多态性是肺鳞癌发生的危险因素，其中tt+Tt基因型携带者发生肺鳞癌的风险是TT基因型携带者的0.556倍(OR=0.556，95%CI=0.393～0.785)。按是否吸烟分层分析：吸烟人群中，Taq1位点基因多态性在病例组与对照组间差异有统计学意义，tt+Tt基因型携带者发生肺鳞癌的风险是TT基因型携带者的0.049倍 (OR=0.049，95%CI=0.259～0.929)；t等位基因携带者发生肺鳞癌的风险是T等位基因携带者的0.444倍(OR=0.444，95%CI=0.241～0.817)。而VDR Apa1位点多态性与肺鳞癌易感性无相关性。结论VDR Taq1基因多态性与肺鳞癌的遗传易感性相关，tt+Tt基因携带者肺鳞癌发病风险降低；t等位基因与患肺鳞癌风险呈负相关；吸烟者中tt+Tt基因携带者肺鳞癌的发病风险显著降低。

肺肿瘤；维生素D；基因

肺癌是发病率高、治疗效果差、病死率高、严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，其中肺鳞癌在肺癌中占1/3。维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)普遍存在于机体各组织细胞中，其中淋巴细胞、结肠、肺等部位表达量较高，具有抗肿瘤增殖、使肿瘤体积减小和数量减少等功能。本研究探讨VDR Apa1、Taq1两基因位点的多态性与肺鳞癌易感性之间的关系，旨在找出肺鳞癌的易感因素，为临床探索提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2011年12月—2014年12月河北省秦皇岛市第一医院收治的肺鳞癌患者288例为病例组，均有病理学诊断依据，男性170例，女性118例，年龄52～73岁，平均(62.3±10.2)岁。选择同期健康体检者284例为对照组，男性162例，女性122例，年龄50～79岁，平均(63.0±10.3)岁。2组性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法 记录研究对象一般信息、疾病史和有关临床资料。采集288例肺鳞癌患者和284例健康对照个体肘静脉血5 mL(经枸橼酸钠抗凝处理)，在提取外周血的白细胞DNA之后，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技术方法，对VDR Apa1、Taq1两基因位点行基因型检测。

1.3 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件处理数据。计数资料比较采用χ2检验；危险因素分析采用Logistic多因素回归分析肺；以比值比(odds ratio，OR)和95%可信区间(confidence interval，CI)表示相对危险度。P<0.05为差异有统计学意义

2 结 果

2.1 Apa1位点基因分型结果 Apa1位于3′端第8内含子区，其多态性是由于碱基A→C的突变，PCR产物电泳及测序证实(图1～4)：C等位基因纯合子命名为aa基因型，电泳中产生148 bp和190 bp 2个条带；A等位基因纯合子命名为AA基因型，电泳中产生338 bp 1个条带；杂合子命名为Aa基因型，电泳中产生338 bp，148 bp和190 bp 3个条带。

2.2 Taq1位点基因分型结果 Taq1位于3′端第9外显子区，其多态性是由于碱基T→C的突变，PCR产物电泳及测序证实(图5～8)：C等位基因纯合子命名为tt基因型，电泳中产生110 bp和228 bp 2个条带；T等位基因纯合子命名为TT基因型，电泳中产生338 bp 1个条带；杂合子命名为Tt基因型，电泳中产生338 bp、110 bp和228 bp 3个条带。

2.3 Logistic回归分析 选用非条件Logistic回归分析肺鳞癌的易感危险因素，以是否发生肺鳞癌为因变量，以性别(男=1，女=2)、年龄(<60岁=1，≥60岁=2)、吸烟(是=1，否=2)、Apa1(aa =1，Aa=2，AA=3)、Taq1(TT =1，Tt+ tt=2)的基因型为自变量，结果显示VDR Taq1位点基因多态性、吸烟是肺鳞癌发生的主要危险因素。其中tt+Tt基因型携带者发生肺鳞癌的危险是TT基因型携带者的0.556倍；吸烟者发生肺鳞癌的危险是非吸烟者的2.392倍。见表1。

按是否吸烟进行分层分析。吸烟人群中，Apa1位点基因多态性在病例组与对照组间差异无统计学意义(χ2=0.547，P=0.459)；Taq1位点基因多态性在病例组与对照组间差异有统计学意义(χ2=4.908，P=0.027)， tt+Tt基因型携带者发生肺鳞癌的风险是TT基因型携带者的0.049倍(OR=0.049，95%CI=0.259～0.929)；t等位基因、T等位基因在病例组与对照组间差异有统计学意义，t等位基因携带者肺鳞癌的发病风险是T等位基因携带者的0.444倍(OR=0.444，95%CI=0.241～0.817)。非吸烟人群中，Apa1、Taq1位点基因多态性在病例组与对照组间差异均无统计学意义(χ2=3.104、0.071，P=0.078、0.790)。见表2，3。

图1 采用PCR-RFLP技术方法分析VDR-Apa1单核苷酸多态性基因型

条带1：PCR产物；条带2：AA纯合子；条带3：Aa杂合子；条带4：aa纯合子;M:标记物

Figure 1 The genotype analysis of SNP VDR-Apa1 by PCR-RFLP method

图2 VDR-Apa1 aa位点基因型测序

Figure 2 Sequencing of VDR-Apa1 site aa genotype

图3 VDR-Apa1 Aa位点基因型测序

Figure 3 Sequencing of VDR-Apa1 site Aa genotype

图4 VDR-Apa1 AA位点基因型测序

Figure 4 Sequencing of VDR-Apa1 site AA genotype

图5 采用PCR-RFLP技术方法分析VDR-Taq1单核苷酸多态性基因型

条带1：PCR产物；条带2：TT纯合子；条带3：Tt杂合子；条带4：tt纯合子;M:标记物

Figure 5 The genotype analysis of SNP VDR-Taq1 by PCR-RFLP method

图6 VDR-Taq1 tt位点基因型测序

Figure 6 Sequencing of VDR-Taq1 site tt genotype

图7 VDR-Taq1 Tt位点基因型测序

Figure 7 Sequencing of VDR-Taq1 site Tt genotype

图8 VDR-Taq1 TT位点基因型测序

Figure 8 Sequencing of VDR-Taq1 site TT genotyp

表1 肺鳞癌易感危险因素非条件Logistic回归分析Table 1 Logistic regression analysis of risk factors for SCC

表2 吸烟人群中病例组与对照组基因型和等位基因比较Table 2 The comparison of genetypes and alleles beween patient group and control group in smokers (例数，%)

表3 非吸烟人群中病例组与对照组基因型和等位基因比较Table 3 The comparison of genetypes and alleles beween patient group and control group in non-smokers (例数，%)

3 讨 论

肺癌的疾病演变是多基因参与、多因素交互、众多阶段变化相互作用的结果。吸烟是肺癌的重要致病因素，随着每天吸烟量的增加以及吸烟年数的延长，罹患肺癌的危险也随之增加[1]。暴露于相同致病环境中的个体，并非都会发生肺癌，表明个体之间罹患肺癌的风险存在差异，而这一差异正是由于遗传因素所决定的。单核苷酸突变、缺失及基因多态性等遗传因素决定了不同个体对遗传易感性的差异[2-3]。个体之间外显性的不同、疾病易感性和药物反应性不同的最重要遗传学基础就是存在于整个基因组的单核苷酸多态性[4-5]。

维生素D是目前研究的一个热点课题，因其除了参与钙的代谢外，还调节恶性肿瘤细胞的增殖和分化。维生素D在与VDR结合后具有调节肿瘤细胞的增殖和分化，抑制其生长甚至诱导肿瘤细胞凋亡的作用[6-7]。VDR是类固醇激素/甲状腺激素受体超家族成员之一，本质为亲核蛋白，是一种配体依赖因子[8]，VDR基因的多态性影响了维生素D效应的发挥。有关肺癌组织和肺癌前病变VDR表达的报道中，VDR在60%肺正常组织和61%肺化生组织中呈中-高度核表达。在肺癌组织中，VDR核表达为79%，62%的细胞质缺乏表达[9]。另外，一项关于人类癌症的初步研究，应用免疫荧光技术测量VDR的表达，发现当正常细胞发生恶变时，VDR的表达数量也在发生改变，由此推测这一变化可以作为预测疾病发生的标志[10]。

已有荟萃分析显示：VDR Taq1与患肺癌风险呈负相关，吸烟者中CC /TC(相对于本研究中的tt+Tt)基因携带者显著降低了肺癌的发生风险，Taq1基因在肺部致癌因素特别是吸烟患者中起保护作用[11]；维生素D Apa1 AA基因型与亚洲人患肺癌的风险相关，Taq1 t等位基因和TT基因型与白种人患肺癌风险相关[6]；Apa1可能是肺癌发生的危险因素之一[12]；Apa1、Taq1酶切位点的多态性可能与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的遗传易感性无关[13]；Dogan等[14]学者对VDR Apa1、Taq1与肺癌易感性关系的研究中，证实Taq1多态性可能是肺癌患者致病的危险因素之一，且年龄、吸烟、性别等可能加重这一因素的影响。本研究重点探讨肺鳞癌患者与VDR基因Apa1、Taq1可能的相关性，选用非条件Logistic回归分析得出VDR Taq1位点多态性、吸烟是肺鳞癌易感的危险因素，tt+Tt基因携带者肺鳞癌发病风险降低，t等位基因与患肺鳞癌风险呈负相关，吸烟者中tt+Tt基因携带者显著降低了肺鳞癌的发病风险，而未得出VDR Apa1位点多态性与肺鳞癌易感性相关的结论。也有研究表明，维生素D基因多态性可能对NSCLC晚期患者人群的存活率没有真正的影响[15]。既往研究结论尚有争议，出现不同结果的原因可能是：①不同地理环境、不同种族间基因多态性存在差异；②VDR基因与其他基因存在相互作用，各研究结果的差异与不同人群连锁不平衡类型的差异有关；③选取的样本较片面，可能造成一定程度的结果差异。

综上所述，遗传因素在肺癌发病中所起的重要作用，虽然目前未有确定的结论，但基因位点多态性重要影响仍旧存在。在今后进一步的研究中，应考虑多方面因素加以探讨，以便为肿瘤的早期诊断、个体化治疗和预后评价提供新的思路。

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(本文编辑：刘斯静)

Association of vitamin D receptor gene Apa1 and Taq1 polymorphisms with susceptibility to lung squamous cell carcinoma

YANG Yan-hong1， WU Jian-dong1， ZHOU Wen-wen1， HOU Yan-yan1, YIN Duan-duan,WANG Zhen-zhen2

(1.Department of Oncology, the First Hospital of Qinhuangdao City, Hebei Province, Qinhuangdao 066000, Chian; 2.Graduate School, Chengde Medical College, Chengde 067000, China)

Objective To investigate the relationship between polymorphism of vitamin D receptor(VDR) gene(including Apa1, Taq1) and susceptibility of squamous cell carcinoma of lung cancer(SCC). Methods The blood samples were collected from 288 patients with SCC and 284 healthy individuals. Leukocyte DNA from peripheral blood was extracted. The method of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) was applied to test the genotype of Apa1, Taq1 in VDR gene. Results VDR Taq1 gene polymorphisms is the risk factor of SCC. The SCC risk of tt+Tt genotype carriers is 0.556 times than the TT genotype carriers(OR=0.556， 95%CI=0.393-0.785). Based on stratification analysis of smoking: In smoking group, there is statistical significance in Taq1 gene polymorphisms. The SCC risk of tt+Tt genotype carriers is 0.049 times than the TT genotype carriers(OR=0.049， 95%CI=0.259-0.929). There is statistical significance in t allele and T allele. The SCC risk of t allele carriers is 0.444 times than the T allele carriers(OR=0.444， 95%CI=0.241-0.817). Conclusion Taq1 polymorphism is related to genetic susceptibility of SCC. The tt+Tt gene reduces the risk of SCC. The t allele is negatively correlated with the risk of SCC. Smokers with tt+Tt gene are significantly reduced the risk of SCC.

lung neoplasms; vitamin D; gene

2016-08-07；

2015-12-05

秦皇岛市科学技术研究与发展计划(201101A259)

杨雁鸿(1966-)，女，河北秦皇岛人，河北省秦皇岛市第一医院主任医师，医学硕士，从事恶性肿瘤诊治研究。

R734.2

A

1007-3205(2017)01-0020-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.01.005