水产降解菌筛选一般方法及可能存在的问题

杨移斌 艾晓辉

水产降解菌筛选一般方法及可能存在的问题

杨移斌 艾晓辉

随着社会经济的不断发展，人们生活水平不断提高，人们对食品、环境等安全意识不断提高。因此在水产养殖中应用有益微生物替代化学药物的呼声高涨，同时也引起了广大科研及养殖工作者积极回应。目前水产中微生态制剂主要分为三大类：①水质改良类。主要用于水质调节，养殖池底改良，有毒有害物质分解，抑制有害藻类或促进有益藻类生长等。②病原拮抗类。主要用于抑制水产病原的生长繁殖，预防病害的暴发。③促鱼类生长及免疫增强类。主要功能是促进鱼类生长，增强鱼类抵抗力，调节肠道健康。随着微生态制剂在水产养殖中应用范围不断扩大，快速筛选有效安全的益生菌株成为了研究的热点。本文就常用微生态制剂中水质改良类之一的降解菌筛选方法做一个探讨，并分析本人认为可能存在的一些问题，以期与水产同行交流，更好地促进降解菌在水产中的应用。

1 降解菌筛选一般方法

1.1 富集培养

在锥形瓶中加入100mL蒸馏水，121℃灭菌。无菌条件下取10g可能含有降解菌的样品于上述培养基中，于30℃、180rpm震荡培养3天。

1.2 驯化培养

在锥形瓶中加入基础盐培养基100mL，121℃灭菌后，加入0.5mL已过滤的目标降解物标准液，使目标降解物的终浓度为50mg/L。在无菌条件下取土壤培养液的上清液，于30℃、180rpm震荡培养5天。5天后按10%的接种量取培养液上清液，接入到目标降解物浓度为100mg/L新鲜的基础盐培养基中，同法培养5天。逐次提高目标降解物的浓度，每次提高50mg/ L，使基础盐培养基中目标降解物终浓度为300mg/L。

1.3 分离纯化

从最后一次驯化培养液涂布得到的平板挑取单菌落，进行划线纯化，得到单菌落后再挑取单菌落进行划线，对在培养基上生长良好、传代稳定的不同菌株进行编号后，于4℃冰箱保存，以进行下一步降解能力的测定。

1.4 菌株降解能力测定

从平板上挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，于30℃、180rpm摇床培养48h，4000rpm离心10min收集菌体，用0.02M磷酸盐缓冲液洗涤2次，再用相同缓冲液制成菌体悬独液作为种子液。以10%的接种量，将种子液接种到含有100mg/L目标降解物的基础盐培养基中，于30℃、180rpm摇床培养5d，以不接菌的目标降解物培养液为空白，每24h取样测OD600，5d后经色谱法测定菌株对目标降解物的降解率。

1.5 菌株的鉴定

对分离得到的菌株培养至对数生长期进行形态观察、电镜观察、生理生化实验，在此基础上进行16S rDNA基因序列分析。其中生理生化实验包括：革兰氏染色实验、葡萄糖发酵实验、淀粉水解实验、氧化酶实验、接触酶实验、甲基红实验。

2 存在的问题

通过上述试验一般可以分离到相应的菌株，但其在验证效果时却发现不理想，最后鉴定的结果一般都是芽孢类菌株。导致这种结果的原因为富集培养时可能存在的降解菌并没有很好地生长繁殖，数量也没有明显的增加，芽孢等却迅速增长，而在驯化培养时加入目标降解物，因为环境等恶劣变化，降解菌此时也不太可能迅速生长繁殖，而芽孢等却可以通过孢子的形式存活下来，故在分离时芽孢等的数量反而占优势。这也解释了现阶段为何芽孢类的产品居多，因为其存活能力很强。我们通过如此强烈针对性方法去筛选，最后却很可能在验证降解能力时得到一次次失败的结果，这个方法很可能是我们科研工作者的一厢情愿。

3 建议

笔者建议在进行降解菌筛选时不要走捷径，与其花费很多时间与精力去寻找方法，不如踏踏实实地使用最原始的方法，即采取先将可能含有降解菌的样品稀释涂布于不同培养基上，28℃恒温培养24h后，得到多种菌株纯培养物，再进行菌株降解能力验证。本方法虽笨拙、工作量大，但却稳步向前，反而易达到目的，获得相应的降解菌株。

（通联：430223，中国水产科学研究院长江水产研究所 电话：17771809619）