橘子酒生香酵母的优选研究

陈清婵，朱娜娜，孙爱红

（荆楚理工学院生物工程学院，湖北荆门448000）

橘子酒生香酵母的优选研究

陈清婵，朱娜娜，孙爱红

（荆楚理工学院生物工程学院，湖北荆门448000）

通过对从橘子果实上分离筛选出的3株天然野生菌株和5株商业果酒酵母的发酵速度、发酵力、感官品质和气相分析结果进行系统比较研究，从中筛选出适宜橘子酒酿造的优良生香酵母菌株JZ-3。发酵力为0.20 g/g·d，主发酵速度相对较低，到发酵后期的速度平缓，对于果酒香气的形成和风味物质的积累十分有利,酿造出来的橘子酒品质最佳，酒体呈现出浅橘黄色，较为澄清透明，且酒体光泽度好，具有橘子清新的果香和纯正、协调的酒香，具有典型性，酒的整体品质较高。

橘子酒；香气；生香酵母

橘子酒是一种营养丰富的低酒精度果酒，风味品质是其重要的质量指标。正常果酒应该酒香醇厚，果香浓郁，具有典型性。但市场上的橘子酒却呈现果香味淡薄、品质不高、典型性不足的现状。酵母是影响果酒品质的重要因素，在橘子酒酿造中，缺乏专用生香酵母一直是影响橘子酒品质的重要原因。国内对猕猴桃果酒[1]及其他果酒生香酵母及其性能都做过研究[2-6]，但在柑橘果酒方面，国内研究多集中在酿造工艺[7-8]及选育适宜酿酒的酵母方面[9-13]，在橘子酒生香酵母方面研究比较少。

本实验通过对从橘子果实上分离筛选出的天然野生优良菌株和优选的商业果酒酵母的酿造性能、所酿造橘子酒的感官品质和生香性能进行系统比较研究，从中筛选出生香能力强并且橘子香气物质保留最好的优良酵母菌株，为进一步研究橘子酒专用生香酵母提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料：橘子，荆门本地产；白砂糖，武汉广盛元食品有限公司；陈酿红葡萄酒专用酵母、白葡萄酒专用酵母、X16酵母、23 23酵母、安琪果酒酵母，烟台帝伯仕自酿机有限公司。

主要试剂：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（分析纯），Beijing Solarbio Science；亚硫酸（分析纯），天津市东丽区天大化学试剂厂；无水硫酸钠（分析纯），天津市福晨化学试剂厂；二氯甲烷（分析纯），天津市福晨化学试剂厂；丙酮（分析纯），国药试剂；无水乙醇（分析纯），武汉市洪山中南北化工试剂有限公司。

仪器设备：JJ-CJ-2FD双人单面净化工作台，苏州金净科技仪器有限公司；LRH-150-S恒温培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；YQL-100S11高压灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备；GL21M离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司；ZHWY-200B恒温摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；GC-4000A气相色谱仪，北京东西电子。

1.2 实验方法

1.2.1 橘子酒野生酵母的分离纯化

本实验从橘子果实上分离纯化野生酿酒酵母。挑选腐烂并带有酒香味的橘子于无菌水中制得悬菌液，在28℃PDA培养基上进行平板培养3 d，观察其菌落特征，分离出单个菌落，逐步进行分离纯化。将适宜菌株转移至试管斜面以28℃进行增殖培养，3 d后转移到4℃冰箱中保藏备用，使用前用橘子清汁扩大培养24 h。

1.2.2 橘子酒酿造工艺

调糖：用白砂糖调整橘子汁糖度为20°Bx。

调SO2：用亚硫酸调整SO2浓度为100 mg/L。

橘子清汁：橘子剥皮、榨汁、过滤、调整可溶性固形物为20°Bx，加入亚硫酸调整SO2浓度为100 mg/L，获得可直接使用的橘子清汁，冰箱低温保存备用。

1.2.3 菌种活化

斜面酵母菌株的活化：用接种环取1环保存的斜面酵母转接到PDA斜面培养基上，培养箱中28℃培养24～48 h，至酵母长满斜面。

干酵母的活化：称取0.02 g干酵母，置于调好的100 mL橘子清汁中于30℃水浴锅中水浴活化15 min。

1.2.4 菌种扩大培养

从活化斜面培养基上取1环活化菌种接入50 mL经灭菌处理的橘子清汁中，28℃摇床培养24 h振荡速度120 r/min。

1.2.5 各酵母菌株的发酵速度与发酵力比较

分别将各菌株扩大培养液按5%的体积比例接入到100 mL橘子清汁中，摇匀后25℃培养，于培养箱中恒温发酵，每隔24 h称重1次记录CO2失重量，至相邻2次失重之差小于0.1 g为发酵终点，终止发酵，将发酵液于4000 r/min离心10 min，收集各菌株发酵后的菌泥，并称重，按公式计算各菌株的酵母发酵力，同时绘制橘子汁发酵液失重与发酵时间曲线，比较各酵母菌株发酵速度的快慢。

单位酵母发酵力（g/g·d）=CO2失重量/菌泥重×发酵时间。

1.2.6 各菌株酿造橘子酒感官评定

参照葡萄酒评比标准（OIV公布）结合葡萄酒果酒通用分析方法（GB/T 15038—2006）由5名人员(男女比例3∶2)对各菌株酿造橘子酒进行感官评定，评定指标及分值见表1。

1.2.7 各菌株酿造橘子酒香气比较

1.2.7.1 二氯甲烷萃取香气物质

取离心后的样品50mL，分别用20mL、20mL和10mL的二氯甲烷连续萃取3次。萃取的香气物质，用3 g无水硫酸钠干燥24 h，第2天将干燥好的样品进行过滤，注意要保证样品中不能有水分，将样品装入1 mL的棕色瓶中，作为样品进行检测。

1.2.7.2 气相分析检测

GC条件：DB-Wax色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25µm）；程序升温为初温40℃，保留5 min，然后以2℃/min升温至60℃，再以3℃/min升温至230℃保留5 min，设置气化室A温度为250℃，氢焰为150℃，温度达到标准后，点火，30 min后待基线平稳，用进样器取1µL样品迅速打入机器中，待样品充分挥发后，统计出峰结果。

1.2.7.3 气相分析数据分析统计

分析统计橘子清汁及各酵母所酿橘子酒香气物质数量，以归一化计算各香气物质的峰面积，作为各香气成分的相对含量。根据香气物质种类数及含量比较各菌株的生香性能。

2 结果与分析

2.1 橘子酒酵母的分离、纯化

经富集培养以及反复分离、纯化操作，得符合酵母特征的酵母菌3株，命名为JZ-1、JZ-2、JZ-3。通过观察,其菌落、菌体特征分别见图1—图3。

从图1可知，JZ-1酵母菌落呈乳白色，圆形，边缘无绒毛，大而厚，有一定凸起度，表面有光泽且黏稠，易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位颜色都很均一。

从图2可知，JZ-2酵母菌落呈微黄色近透明小菌落，圆形，边缘光滑，略微凸起，表面有光泽黏稠，易挑起，均一性良好。

从图3可知，JZ-3酵母菌落呈微黄色小菌落，数量多，椭圆形，边缘有小绒毛，略微凸起，表面有光泽黏稠，易挑起。

2.2 各菌株发酵力比较

通过对野生分离的3株酵母菌株和商用5株果酒酵母在橘子清汁中发酵过程中5 d内CO2的总失重量及各菌株的总菌泥重，通过公式计算比较8株酵母菌的单位酵母发酵力，结果见表2。

由表2可知，安琪酵母、JZ-1、红葡萄酒专用酵母、白葡萄酒专用酵母等发酵力明显高于其他4株酵母，均达到了0.37 g/g·d以上，安琪酵母甚至达到了0.43 g/g·d，而JZ-2、JZ-3、23 23等酵母的发酵力都比较低，分别为0.19 g/g·d、0.20 g/g·d、0.16 g/g·d。发酵力越低，发酵速度相对越平稳，对果酒香气的形成和风味物质的积累越有利，而发酵力高的酵母，其发酵速度快，酒的风味相对较烈不够协调柔和。单位酵母发酵力相对越低，更有利于提高橘子酒整体质量。因此JZ-2、JZ-3、23 23酵母更适于作为优选生香酵母菌株。

2.3 各菌株发酵速度比较

通过对野生分离的3株酵母菌株和商用5株果酒酵母在橘子清汁发酵过程中5 d内CO2的失重量统计，绘制CO2失重量随发酵时间的变化曲线，即8株酵母菌株的发酵速度曲线，结果见表3。

由表3可知，8种菌株发酵速度呈3种不同趋势。红葡萄酒酿酒酵母、X16、23 23这3株酵母起酵速度最快，主发酵速度较快，发酵延滞期短；JZ-1、安琪酵母、白葡萄酒专用酿酒酵母等3株酵母发酵速度先降后升，并且主发酵速度最快，但延滞期最短，到达最高发酵速度后立刻下降；JZ-2、JZ-3菌株启发速度较慢且平缓，延滞期最长。发酵速度快，酒的风味相对较烈不够协调柔和。主发酵速度相对较慢，到发酵后期的速度更为平缓，对于果酒香气的形成和风味物质的积累十分有利，可提高橘子酒品质。因此，JZ-2、JZ-3菌株更适于作为优选菌株。

2.4 各菌株酿造橘子酒感官品质比较

由表4可知，菌株JZ-3所酿橘子酒的外观、滋味、香气和典型性都比较好，综合得分排在第一位。JZ-1、安琪、23 23所酿橘子酒外观、香气都不理想。陈酿红葡萄酒专用酵母所酿橘子酒典型性差，橘子原来香气保留太少，白葡萄酒专用酵母所酿橘子酒酒香果香单薄,典型性差，X16、23 23所酿橘子酒香气略胜于白葡萄酒和红葡萄酒专用酵母，但外观较前者差，典型性同样比较差。安琪整体品质居中，但远远逊色于菌种JZ-3所酿橘子酒。陈酿红葡萄酒专用酵母、白葡萄酒专用酵母、X16、23 23等所酿橘子酒略带苦涩辛酸气味，整体杂味比较多，口感差。通过比较可知，菌株JZ-3的酿造性能显著优于其他酵母菌株，酿造的橘子酒外观好，酒体呈现出浅橘黄色，较为澄清透明，且酒体光泽度好；酒体较丰满、醇厚爽口；香气特征为具有橘子清新的果香和纯正、协调的酒香，能很好体现橘子酒的典型性，酒的整体品质较高。

2.5 各菌株酿造橘子酒香气比较（表5、表6）

由表5可知，通过气相色谱法分析检测，橘子清汁含气味物质22种，但相对含量都比较低；陈酿红葡萄酒专用酵母、白葡萄酒专用酵母所酿橘子酒气味物质种类最多，分别为30种、40种；JZ-1、23 23等酵母所酿橘子酒气味物质种类最少，分别为12种、19种，甚至低于橘子清汁气味物质种类；并非所有气味物质都有利于橘子酒香气形成，由于仪器设备限制不能检测出气味物质具体成分，故通过对气相分析所得数据分析统计得到各菌株所酿橘子酒橘子清汁香气物质保留数量。

由表6可知，JZ-3酵母菌株保留橘子清汁香气物质10种，总含量5.7642%，是8株酵母中保留种类最多、含量最大的一种；安琪酵母适用于大部分果酒酿造，所以在橘子清汁香气物质保留数量和含量方面都仅次于JZ-3酵母菌株，居第二位；JZ-1、X16、23 23等酵母菌株橘子清汁香气物质保留最少。因此，JZ-3酵母菌株发酵橘子酒，橘子果味典型性最好，这与感官评定的结果相符。

3 结论

在8株酿酒酵母中，JZ-3菌株菌落呈白色，圆形，较厚，有一定的凸起，边缘略微锯齿状，表面有光泽且有弹性，易挑起。发酵力为0.20 g/g·d，主发酵速度相对较低，到发酵后期的速度平缓，对于果酒香气的形成和风味物质的积累十分有利,气相分析得JZ-3菌株所酿橘子酒含香气物质22种，保留橘子清汁香气物质10种，含量为5.7642%。感官评价得分87.8分，酿造出来的橘子酒品质最佳，酒体呈现出浅橘黄色，较为澄清透明，且酒体光泽度好，酒体较丰满、醇厚爽口，香气特征具有橘子清新的果香和纯正、协调的酒香，具有典型性，酒的整体品质较高。

[1]罗安伟.猕猴桃酒生香酵母的选育[D].西安:西北农林科技大学,2012(4)：36-67.

[2]王国良.生香酵母及其应用[J].食品研究开发,2007(3)：16-29.

[3]傅金泉.生香酵母在黄酒生产上应用的研究初报[J].酿酒科技,1996(5)：50.

[4]汪立平.苹果酒酿造中香气物质的研究[D].无锡：江南大学, 2004.

[5]许玲.几株生香酵母的分离筛选及应用[J].酿酒科技,2010 (12)：48-54.

[6]周世水.酒曲中生香酵母的分离鉴定与产酯工艺优化[J].现代食品科技,2010(1)：90-108.

[7]潘训海,左勇.锦橙果酒开发研究[J].四川食品与发酵,2007 (4)：40-44.

[8]陈清婵,简清梅,王劲松,等.蜜桔果酒发酵工艺[J].中国酿造, 2015,34(1)：169-171.

[9]陈茂彬,何平,曾莹.柑橘酒酿造酵母的筛选及特性研究[J].酿'酒科技,2007(1)：20-22.

[10]游见明.橘子酒酵母的分离筛选[J].中国酿造,2009(4)：55-57.

[11]熊子书.中国酿酒酵母菌的研究[J].酿酒科技,2002(4)：23-27.

[12]李静.果酒酿造中优良酵母菌株的筛选[J].酿酒科技,2008 (2)：63-65.

[13]权英,张伟,李长文,等.酿造红枣果酒的酵母菌选种研究[J].食品与发酵工业,2004,30(11)：39-41.

Screening of Aroma-Producing Yeast Strains for Orange Wine

CHEN Qingchan,ZHU Nana and SUNAihong
(College of Bioengineering,Jingchu University of Technology,Jingmen,Hubei 448000,China)

The fermenting rate,fermenting power,sensory quality,and GC analytic results of 3 wild yeast strains isolated from orange fruit and 5 commercially-available fruit wine yeast strains were compared.Finally,yeast strain JZ-3,suitable for orange wine production,was screened out.Its fermenting power was 0.20 g/g.d,and its fermenting rate was comparatively low in chief fermentation period and was stable in late fermenting period,which was beneficial to the formation of wine aroma and the accumulation of flavoring substances in wine.The wine produced by strain JZ-3 was pale orange yellow in color,clear and transparent with good gloss.Besides,the wine had pure orange aroma and harmonious taste and its overall quality was high.

orange wine;aroma;aroma-producing yeast

TS262.7；TS261.1；TS261.4

A

1001-9286（2017）03-0065-04

10.13746/j.njkj.2016367

湖北省教育厅科学研究计划资助项目（Q20154304）。

2016-12-09

陈清婵（1983-），女，讲师，博士，研究方向为风味食品，E-mail：xiaochan434@hotmail.com。

优先数字出版时间：2017-02-13；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170213.0943.001.html。