免疫组化稳定表达与精细操作

●侯君

免疫组化稳定表达与精细操作

●侯君

若想要使免疫组化实现稳定表达，需要将免疫组化染色工作做好。进行免疫组化染色需要拥有综合性的染色技术，在进行染色过程中多种因素会对染色工作造成影响，所以对免疫组化染色工作质量加以管理并提高染色工作的可信性显得非常重要。我国医疗事业单位对免疫组化染色工作开展从21世纪初开始，经过十余年的发展，对免疫组化染色工作中的精细操作已经有了非常大的进步，本文就将对精细操作模式下染色工作质量控制各项内容，进行陈述。

免疫组化;精细操作;质量管理

免疫组化稳定表达是依靠免疫学中的抗原体反应原理，并通过化学反应使对组织细胞进行定位的显色剂显色，以此达到对组织细胞定性以及定量研究目的。因为这项操作处于细胞层次，所以若想要使免疫组化染色工作能够实现稳定表达，就需要对染色过程中的各步骤进行精细化操作。下文就将对精细化操作的各项内容进行论述。

1 固定标本

进行染色标本固定时，需要在标本离体之后立即进行，固定液为10毫升甲醛加上90毫升PBS缓冲液所构成浓度为4%的中性缓冲甲醛，固定液的用量要达到固定标本体积的6倍。进行标本固定时，无论是固定时间过长或过短，还是固定不稳固都会导致标本抗原失去，因此在进行固定时要做到及时且稳固。固定的时间小标本不能小于六个小时，肿瘤标本则是不能低于24小时。此外，进行淋巴结及根治标本的固定时要切开。

2 切片、烤片及脱蜡

经过固定之后，标本要进行切片。切片时需做到切片轻薄且完整，非淋巴组织切片厚度一般为3到4微米，淋巴组织切片为2微米。因为在对切片若出现褶皱将很难清洗洁净，会影响到染色效果，所以要保证切片平整。在进行切片清洗时，容器要洁净以免产生意外污染，对阅片造成影响。进行烤片时，温度要保持在70℃左右，时间为一到两小时。烤片时温度以及时间太长过高会使标本抗原失去，时间过短则容易出现脱片现象。烤片之后进行脱蜡，脱腊工作不彻底会导致抗体与抗原之间结合受到阻挡。进行脱蜡时一般采用松节油，分为三级进行，每一级时间保证在15分钟左右。松节油的使用为200片切片进行一次更换，这样能够保证脱蜡效果良好[1,3]。

3 降低非特异性染色

采用辣根过氧化物酶作为检测系统，需在进行一抗滴加工作之前，将3%浓度过氧化氢滴加到切片上，保持15分钟左右进行反应，将切片组织物中的内源性过氧化物酶进行消除，以免对检测工作造成干扰。

4 设立对照组

进行免疫组化染色工作时，需要设立对照组。对照组的设立是非常重要的一项工作，设立对照组为阳性。因为阑尾组织中的组织成分较多，包括间质、神经组织以及淋巴组织和上皮组织等，所以通常会将阑尾选择为阳性对照组[2]。

5 恢复抗原

进行抗原修复时，有多种方法，包括微波及高压锅修复等方法，在本文中选用高压锅修复法。具体的修复流程是：首先在高压锅内放入两千毫升0.01摩尔每升，ph值为6.0的柠檬酸盐缓冲液，然后将高压锅放到电磁炉上进行加热，直至沸腾。其次，将电磁炉功率换成中档，然后将切片放到高压锅内，然后将高压锅盖盖住，加减压阀并再次进行加热，当高压锅开始冒气再维持两分钟，然后再熄火并进行冷却。采用高压锅法进行抗原修复，拥有受热及压力稳定和切片背景着色淡的好处。除此之外，进行核染色阳性抗原修复时，最好的方法是采用ph值为9.0的EDTA修复液，胞质及胞膜染色阳性抗原修复也采用上述修复液，但ph值为8.0。

6 显色

若已经完成配置的DAB显色液底部有棕色沉淀物，那么此显色液可能已经没有效果，最好的办法就是重新进行显色液配制。在进行显色时，显色效果快速的位置是大范围阳性分布或者是胞质组织有阳性定位的部位。相反的部位，在进行显色时观察效果不明显，所以需要依靠显微镜。进行显色观察时，时间要掌握好不能过长，否则很容易使背景染色，对显色效果造成影响。

7 复染

为了能够使切片的阳性染色显色效果达到最优，需要进行复染操作。因为进行切片的复染操作主要是为了使显色达到更好效果，所以苏木精的颜色应尽量保持清淡。而且在进行复染操作时，还须要用到吸附玻片，所以要对苏木精进行及时的过滤，避免因为人为因素而造成背景被染色，对免疫组化染色显色观察效果造成严重影响[4]。

8 染色细节

在进行免疫组化染色操作时，需要注意以下几个方面。首先，因为标本切片一旦干燥，就会使切片内部的抗原因失去水分而流失，这种情况会对后续的染色以及显色工作造成严重影响，因此在整个染色过程中要确保切片能够保持湿润，以此保证免疫组化染色质量。其次，则是在进行一抗的滴加时，切片上的多余水分会使抗体被稀释，所以要将切片上的水分进行清除。而且在进行抗体滴加时，要保证滴加的范围能够将所有组织都囊括进去，避免出现边缘部位没有覆盖到抗体，出现边缘效应现象。此外，在进行一抗滴加时要保证孵育盒的放置角度水平，以免在进行抗体的滴加时抗体从组织切片的一端流向另一端，避免后续的染色显色结果出现假阴性亦或是部分弱阳性，降低染色工作效果，增加工作时间[5]。

9 结束语

结合上述论述内容，我们可以发现想要使免疫组化染色质量控制工作效果达到最优，需要将各项控制措施在实验检测之前进行实施，例如对标本及切片的处理工作。在免疫组化染色操作流程中，各项工作之间都会产生影响，而且这种影响是非常严重的。所以对于各项操作流程要严格按照顺序进行，并对每一个步骤内的操作进行严格监督与控制，只有这样才能使切片以及标本质量达到最优，为后续的染色及显色工作奠定良好基础。在进行操作时，工作人员需具有高度责任感，并且拥有娴熟的操作技术，严格按照要求进行实验操作。

(作者单位：河北省眼科医院病理科)

[1]刘彤华.免疫组织化学规范化的问题[J].中华病理学杂志 ,2009,(10)：29.

[2]戴光强,龚西.诊断病理学分册[M].合肥：安徽科学技术出版社 ,2003,(06)：55-57.

[3]斯向东,李庆.细胞块切片及免疫组化在恶性浆膜腔积液诊断中的应用体会[J].中国现代医生,2012,48(27)：115-116.

[4]张志刚,梁希军,崔东辉,等.间皮细胞、癌胚抗原、角蛋白、波型蛋白在胸腔积液临床诊断中的作用[J].中国全科医学 ,2008,11(23)：2081-2082.

[5]张雯雯,孔庆暖,韩增磊,等.小细胞肺癌组织CD56、Syn及TTF1表达及联合诊断意义[J].齐鲁医学杂志,2014,27(3)：108-110.

[6]赵海滨,杨树东,周志华,等.肾原发性神经内分泌癌临床病理观察[J].诊断病理学杂志,2010,19(3)：120-122.