异源表达细菌β-甘露聚糖酶研究进展

那 金，王 瑶，郭尚旭，赵 丹

（1黑龙江大学生命科学学院微生物省高校重点实验室，哈尔滨150080；2黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨150500）

异源表达细菌β-甘露聚糖酶研究进展

那 金1,2，王 瑶1,2，郭尚旭1,2，赵 丹1,2

（1黑龙江大学生命科学学院微生物省高校重点实验室，哈尔滨150080；2黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨150500）

甘露聚糖酶是一类水解甘露聚糖的关键酶，广泛存在于动植物和微生物中，细菌来源尤为广泛。为了更好地满足工业生产的需求，异源表达细菌来源的甘露聚糖酶基因，以获得性质优良的甘露聚糖酶。对甘露聚糖酶的来源和酶学性质进行了概述，归纳了细菌甘露聚糖酶的异源表达在提高酶活、扩大pH值作用范围、改善安全性等方面的作用，包括对埃希氏大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及毕赤酵母进行异源表达等。利用微生物资源拓宽甘露聚糖酶的应用领域，使用微生物技术提高产酶量满足工业需求，并为甘露聚糖酶定向进化和改造奠定基础。

细菌；甘露聚糖酶；分子生物学；异源表达；应用

0 引言

甘露聚糖是一类自然界中储量非常丰富的半纤维素多糖[1]，在造纸、纺织、化妆品等行业都有应用[2]。甘露聚糖粘度高、水解困难，难以被动物和人体直接利用[3]。β-甘露聚糖酶(EC3.2.1.78，β-mannanse，以下简称甘露聚糖酶)是能够随机水解任意β-1,4-糖苷键的内切水解酶[4]，广泛存在于植物、动物和微生物中[5]。许多已发芽的植物种子如芦笋、魔芋以及番茄果实和种子中都含有甘露聚糖酶[6]。动物源的种类较少，且大多数属于软体动物，如皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)、滨螺(Littorina brevicula)、贻贝(Mytilus Edulis)等[7]。相比而言，微生物来源的甘露聚糖酶具有活性高、成本低、提取方便以及作用条件宽泛等特点，已在工业生产和理论研究中得到了广泛应用，如饲料、食品、医药、石油开采以及尚未开发的生物能源等领域[8]。

微生物发酵产甘露聚糖酶往往受初始酶活低，菌株生物安全性无保障等限制，难以大规模工厂化生产。随着基因和蛋白质工程技术的广泛运用，甘露聚糖酶的研究开始转向产酶基因的克隆和异源表达等方面。国内外对异源甘露聚糖酶表达的研究主要集中在从环境中对产酶菌株进行诱变选育[9]，并将不同微生物的甘露聚糖酶基因克隆在埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)[10-11]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[12]及毕赤酵母(Pichia pastoris)[13]等不同微生物中表达。本研究将对细菌甘露聚糖酶的来源、性质、异源表达等方面的研究进行综述。

1 甘露聚糖酶来源及酶学性质

1.1 来源

甘露聚糖酶作为一类重要的半纤维素酶(Hemicellulase)，植物种子、动物以及各种微生物中都有存在[14-15]，其中甘露聚糖酶的微生物源种类最为丰富。初步统计已发现100余种产酶微生物，包括细菌、真菌和放线菌等[16-17]。其中真菌主要是酵母菌(Saccharomycetessp.)、青霉菌(Penicilliumsp.)、曲霉菌(Aspergillussp.)和木霉菌属(Trichodermasp.)等，而放线菌以链霉菌(Streptomycetesp.)为主[14]。细菌中研究较多的是弧菌(Vibriosp.)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)等，研究最多的是Bacillussp.，如嗜碱芽胞杆菌(B.alkalophilic)，地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)等[18]。大多数细菌来源的甘露聚糖酶都是胞外酶，酶活力高，更容易提取[19]，已然成为国内外众多研究者的主要研究对象。

1.2 最适反应pH值和温度

不同微生物所产的甘露聚糖酶的分子质量、最适反应pH值、最适反应温度、酶动力学常数、底物专一性等都有一定的差异。甘露聚糖酶的分子质量小的只有22 kDa，大的可以达到162 kDa，相差十分悬殊，但大部分集中在30～55 kDa之间[20]。不同微生物来源的甘露聚糖酶作用pH值和温度也不尽相同，真菌来源的甘露聚糖酶的作用范围偏酸，一般在pH 4.0～5.5之间，最适反应温度一般在55℃～75℃。Katrolia等[21]对来自Chaetomiumsp.的甘露聚糖酶进行研究，结果表明，该酶的最适pH 5.0，最适反应温度为65℃。

细菌甘露聚糖酶中研究最多的是Bacillussp.，除B.alkalophilic高至pH 9.0以上之外，最适反应大多在pH 5.5～7.0。最适反应温度一般为45℃～70℃。李云程等[22]研究的Bacillussp.B555，最适反应pH 7.0，最适反应温度为50℃～55℃。Sudip等[23]从传统韩国食品泡菜分离和鉴定一株产甘露聚糖酶的Bacillussp.CSB39，最适反应pH 7.5，最适反应温度为70℃。与真菌来源的甘露聚糖酶相比，细菌来源的甘露聚糖酶最适作用pH值可以由弱酸到碱性，作用温度范围更加宽泛，甘露聚糖酶的性质更多元化，应用范畴更广泛。

2 甘露聚糖酶基因的异源表达

2.1 异源表达的意义

大多数野生型菌株来源的甘露聚糖酶自身稳定性和催化活性较差、底物亲和力弱、Km值高，且产酶菌株生物安全性无保障，工业化应用具有一定的局限性[24]。异源表达的意义在于克服以上限制，从而获得作用宽泛，生产成本低，安全性高的甘露聚糖酶[25]。

Gyeong等[26]的研究表明，异源甘露聚糖酶与野生型甘露聚糖酶性质基本一致，包括最适pH值和温度、热稳定性和动力学参数。异源表达还可以扩大甘露聚糖酶的pH值作用范围。Zang等[27]研究的在E.coli中异源重组甘露聚糖酶的最佳约在pH 6.5，并且在pH 5～11的范围稳定。

马鑫等[28]研究在E.coliBL21中表达的重组酶在25～95℃，在pH 3.0～9.6范围内均具有酶活性，在pH 3.0的酸性环境中依然具有1234 U/mg的比活力和宽泛的作用温度区间，并且在酸性环境还拥有较高活力，可以应用于生产作用于动物胃中的饲料和药品工业中。随着甘露聚糖酶研究的推进，关于异源表达甘露聚糖酶的研究日新月异，重组甘露聚糖酶的作用条件的范围也更加广泛。

2.2 甘露聚糖酶异源表达系统

2.2.1 大肠杆菌表达系统 在过去十年中，E.coli已经成功地用作安全菌株(generally regarded as safe，GRAS)[29]。陆续有一些细菌来源的甘露聚糖酶基因在E.coli系统中过表达，并获得较高的酶活力。Kim等[30]克隆Cellulosimicrobiumsp.的甘露聚糖酶基因(1272 bp)并在E.coli中表达，在50℃和pH 6.0条件下对甘露聚糖表现出较高的催化活性。成莉凤等[31]从欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)中克隆甘露聚糖酶基因，转化到E.coliBL21(DE3)中，重组甘露聚糖酶活性高达645.5 U/mL，是出发菌株的1.97倍。

Liu等[32]将B.subtilisYH12甘露聚糖酶基因在E.coliJM109中表达，在55℃和pH 6.5的条件下表现出很高的催化活性。唐嘉婕等[33]从短小芽孢杆菌(B.pumilus)Nsic-2中克隆得到甘露聚糖酶基因(manB)，在E.coliBL21(DE3)中成功地表达，得到甘露聚糖酶最高酶活为11021.3 U/mL。与原始菌株相比，重组甘露聚糖酶不仅酶活力高，并且在pH 6.0～9.0之间酶活相对稳定，碱性条件下也表现出较高的稳定性，因此其在工业应用中具备较高的潜在应用价值。Gaurav等[34]将来自Bacillussp.的manb-1601基因在E.coliBL21(DE3)细胞中进行表达，使得重组甘露聚糖酶(ManB-1601)的生产量提高2.73倍，大大提高了产量。与野生型菌株产酶相比，E.coli具有更好的表达、完善的遗传构成和快速生长的能力，而成为细菌异源表达甘露聚糖酶最常用的宿主。

2.2.2 枯草芽胞杆菌表达系统B.subtilis作为外源表达的宿主菌已经广泛地应用到基因的克隆及过量表达过程中。Xu等[29]将来自B.subtilisB10-02甘露聚糖酶gmuG基因在B.subtilis亚种中过表达，原始菌株在酸性条件下稳定性不佳。重组酶不仅在pH 6.5～8.0的范围内稳定，还使得纯化的重组甘露聚糖酶在pH 7.0下具有3207.82 U/mL的较大活性。由此可见，异源表达不但增加了甘露聚糖酶的酸稳定性，而且体现出较高的酶活力，改良和完善甘露聚糖酶在动物饲料工业中的适用性。

刘项羽等[35]从B.subtilisJNA3-10中克隆出含信号肽的manA2基因，在B.subtilis168中克隆表达。重组菌株的酶活力(235.94 U/mL)是原始菌株(17.96 U/mL)的13.1倍，在65℃和pH 6.5条件下具有较高的活性。B.subtilisJNA 3-10通过异源表达提高了甘露聚糖酶的分泌，使重组菌株有潜力作为饲用甘露聚糖酶出发菌株，为工业化酶的应用提供了新的资源与选择。

2.2.3 其他表达系统 作为乳酸菌(Lactic Acid Bacteria，LAB)的一员，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)是公认的安全菌株。通过食品级表达载体重组表达的酶无需纯化，可用于饲料添加剂等食品级用途，对保持人体健康也有一定的有益作用[36]。Lin等[37]自B.pumilus中克隆manB基因在L.casei中表达。邹业霞等[38]从B.pumilus中克隆manB基因的成熟肽编码序列，将该基因克隆到L.casei中。重组甘露聚糖酶酶活可达23 U/mg，实现了Bacillussp.甘露聚糖酶基因在L.casei中的成功表达，对开拓LAB甘露聚糖酶的应用前景意义重大。

2.2.4 毕赤酵母表达系统 不仅细菌重组可以获得好的效果，真菌也可以作为异源表达的工程菌株。已有Bacillussp.、Penicilliumsp.、Aspergillussp.等不同微生物来源的manB基因在P.pastoris中实现了表达。Junnan等[39]将B.subtilisMAFIC-S11的甘露聚糖酶基因(1029 bp)在P.pastoris中克隆和表达，重组酶表达水平提高了2倍，比活力较高为3706 U/mg。Li等[40]通过PCR克隆将来自B.subtilisBS5的甘露聚糖酶基因整合到P.pastorisGS115的基因组中。重组甘露聚糖酶的最适温度和pH值分别为50℃和pH 6.0，获得的纯化酶的特异性活性很高为7978 U/mg。实现了重组甘露聚糖酶的高活性表达，在酶活性、稳定性等方面表现出独特的性质，将进一步适应实际生产的需要。

3 展望

甘露聚糖的应用范围非常广泛，有很好的应用前景。目前，很多实验室规模的生产甘露聚糖酶的过程中控制和优化技术已经取得了较好的成果，但放大到工业化规模生产上却受到种种限制。为了使甘露聚糖酶更好地服务于人们的生产生活，在现有的基础上，应该继续推进甘露聚糖酶的研究：（1）利用微生物资源生产能广泛用于不同领域的甘露聚糖酶，如将耐高温甘露聚糖酶应用到石油工业中；在造纸工业中应用作用pH值范围宽泛的甘露聚糖酶，以及将更加安全来源的酶应用到食品和医疗中。（2）通过提高菌种产酶水平、酶比活率、酶耐热性，改善产酶发酵工艺，开发出具有活性高、耐高温、满足更多要求的甘露聚糖酶，将其更好地应用于工业及畜牧业的实际生产中。（3）此外，应用研究不能仅满足于实验室研究阶段，充分利用分子生物学手段，不断构建外源高表达体系。加深对甘露聚糖酶基因结构和功能的认识，为其定向进化和改造奠定理论基础。因此，异源表达在工业化生产中的应用将是未来甘露聚糖酶工艺优化的重要发展方向。相信随着研究的不断深入，异源表达的甘露聚糖酶在食品和饲料工业以及在纸和木浆漂白等工业领域的应用将越来越广泛。

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Heterologous Expression Bacterialβ-mannanase:Research Progress

Na Jin1,2,Wang Yao1,2,Guo Shangxu1,2,Zhao Dan1,2
(1Key Laboratory of Microbiology,Life Science College,Heilongjiang University,Harbin 150080,Heilongjiang,China;2Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology,Ministry of Education,Heilongjiang University,Harbin 150500,Heilongjiang,China)

Mannanase is a key enzyme for hydrolyzing mannan,and is widely found in plants,animals and microorganisms,particularly in bacteria.In order to meet the needs of industrial production,heterologous expression of bacterial-derived mannanase gene is studied in order to obtain high-quality mannanase.In this paper,the origin and enzymatic properties of mannanase were reviewed,and the heterologous expression of bacterial mannanase was summarized concerning the aspects of improving the enzyme activity,expanding the pH range and improving the safety,including heterologous expression ofEscherichia coli,Bacillus subtilis and Pichia pastoris.The use of microbial resources can broaden the application of mannanase,and the use of microbial technology can improve the amount of enzyme production to meet industrial needs,these lay a foundation for the determinate evolution and transformation of mannanase.

Bacteria;β-mannanase;Molecular Biology;Heterologous Expression;Application

TS2，C39

A论文编号：cjas17040011

哈尔滨市科技局青年后备人才项目“功能性乳酸菌发酵酸菜生态学过程研究”(2014RFQXJ101)；黑龙江省政府博士后项目“疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)NF-05漆酶的产生、特性及应用研究”(LBH-Z15214)。

那金，女，1994年出生，黑龙江哈尔滨人，硕士，研究方向为微生物学。通信地址：150080黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路74号黑龙江大学224信箱，Tel：0451-86609134，E-mail：najin8023@163.com。

赵丹，女，1980年出生，黑龙江齐齐哈尔人，副教授，博士，研究方向为微生物学。通信地址：150080黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路74号黑龙江大学224信箱，Tel：0451-86609134，E-mail：zhaodan4u@163.com。

2017-04-11，

2017-06-08。