温郁金挥发油通过PI3K/Akt信号途径对阿尔茨海默模型小鼠tau蛋白磷酸化表达的影响

齐越++秦文艳++康凯++姜鸿++李昭++王亚斌++贾冬

摘要：目的 观察温郁金挥发油对阿尔茨海默病（AD）模型小鼠tau蛋白磷酸化的影响，探讨其相关作用机制。方法 60只昆明种小鼠随机分为假手术组、模型组、温郁金挥发油低剂量组、温郁金挥发油高剂量组、盐酸多奈哌齐组和参枝苓组，海马组织注射Aβ25-35制作AD小鼠模型，各给药组给予相应药物灌胃，连续15 d。末次给药后，免疫组化检测小鼠tau蛋白磷酸化位点（Ser 404和Thr 231）的蛋白表达，Western blot 检测tau蛋白磷酸化位点及磷脂酰肌醇-3-激酶信号/蛋白激酶B（PI3K/Akt）的蛋白表达。结果 与假手术组比较，模型组tau蛋白磷酸化位点蛋白表达增加（P<0.05），PI3K及Akt磷酸化水平明显降低（P<0.05）；与模型组比较，温郁金挥发油高剂量组tau蛋白（Thr231和Ser404）磷酸化水平明显降低（P<0.05），PI3K及Akt磷酸化水平明显增加（P<0.05，P<0.01）。结论 温郁金挥发油可降低模型小鼠tau蛋白磷酸化水平，其作用机制可能与PI3K/Akt信号途径有关。

关键词：温郁金挥发油；阿尔茨海默病；tau蛋白；磷脂酰肌醇-3-激酶信号/蛋白激酶B；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.012

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）01-0045-04

Effects of Wenyujin Essential Oil on tau Protein Phosphorylation in Mice with Aβ-induced Alzheimer Disease through PI3k/Akt Pathway QI Yue1， QIN Wen-yan1， KANG Kai2， JIANG Hong1， LI Zhao2， WANG Ya-bin2， JIA Dong2 （1. Department of Pharmacology， The Second Hospital Affiliated to Liaoning Chinese Medical University， Shenyang 110034， China； 2. Laboratory Center， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110847， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Wenyujin essential oil on tau protein phosphorylation in mice with Alzheimer Disease （AD）； To discuss the relevant mechanism of action. Methods Sixty Kunming mice were divided into six groups randomly： sham-operation group， model group， Wenyujin essential oil low- and high-dose group， donepezil group and Shenzhiling group. β-Amyloid protein （Aβ25-35） was infused into the hippocampal of mice. Mice in each group were given relevant medicine for gavage for 15 d. After the last administration， immunohistochemistry was used to detect the expressions of tau protein phosphorylation points （Ser 404 and Thr 231）. Western blot was used to detect tau protein phosphorylation points and the expression of PI3K/Akt protein. Results Compared with sham-operation group， tau protein phosphorylation points in the model group increased （P<0.05）， but the phosphorylation levels of PI3K and Akt decreased significantly （P<0.05）. Compared with the model group， tau protein phosphorylation （Thr231 and Ser404） in Wenyujin essential oil high-dose group decreased significantly （P<0.05）， and the phosphorylation levels of PI3K and Akt increased （P<0.01）. Conclusion Wenyujin essential oil can inhibit tau protein phosphorylation in mice. The possible mechanism may be related to the PI3K/Akt signal pathway.

Key words： Wenyujin essential oil； Alzheimer disease； tau protein； PI3K/Akt； miceendprint

基金项目：国家科技重大专项-重大新药创制（2012ZX09102201-005）

通讯作者：贾冬，E-mail：jiadg2003@126.com

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种以进行性记忆力减退、行为异常和认知功能发生障碍为特征的慢性神经退行性疾病[1]，其主要的病理特征为老年斑沉积、神经原纤维缠结和tau蛋白磷酸化。tau蛋白是微管相关蛋白，含量占整个蛋白家族的80%，与微管的组装和稳定密切相关，对于神经细胞的生长发育、轴突生长、神经元极性形成、轴突的通信传导和物质运输等均有着至关重要的作用[2-3]。温郁金Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling为姜科姜黄属植物的干燥块根，在我国资源丰富，价格低廉，具有活血行气、破瘀、清心解郁之功效。课题组前期研究表明，温郁金挥发油可改善AD模型小鼠学习记忆障碍，减轻神经元的损伤，但其作用机制尚不清楚。本实验观察温郁金挥发油对AD模型小鼠tau蛋白磷酸化的影响，探讨其相关的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级昆明种小鼠60只，雌雄各半，8周龄，体质量（20±2）g，辽宁长生生物技术有限公司，合格证号SCXK（辽）2010-0001。饲养于辽宁中医药大学附属第二医院实验动物中心，室温20～23 ℃，湿度50%～60%，自由饮水进食。

1.2 药物

温郁金购自浙江温州，经辽宁省中医药研究院药学室尤献民研究员鉴定为正品，符合2010年版《中华人民共和国药典》项下规定。挥发油提取：取温郁金药材1 kg，加水6000 mL，提取挥发油8 h，收得挥发油4.5 mL，辽宁省中医药研究院制剂中心制备，药液置于4 ℃冰箱保存备用。参枝苓口服液，山东沃华医药科技股份有限公司，批号5250101；盐酸多奈哌齐片，卫材（中国）药业有限公司，批号140606A。

1.3 主要试剂与仪器

Aβ25-35（Sigma公司），tau-5（Invitrogen 公司），rabbit anti-phospho-tau（Thr231）抗体、rabbit anti- phospho-tau（Ser404）、rabbit anti-PI3K p85抗体、rabbit anti-phospho-PI3 K抗体、rabbit anti-phospho-Akt抗体，北京博奥森生物技术有限公司；Akt抗体，Santa公司；抗β-actin鼠单克隆抗体，康为世纪生物科技有限公司；山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗、山羊抗兔IgG（H+L）二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司；DAB显色试剂盒，福州迈新生物技术开发有限公司；即用型SABC（兔IgG）试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司；水合氯醛，天津市津东试剂厂。DW-200脑立体定位仪（成都泰盟科技公司），TD1002B电子台秤（四川中泯科技公司），Western blot电泳仪（美国BIO-RAD公司），BX51显微镜（日本奥林巴斯株式会社）。

2 实验方法

2.1 造模

参照文献[4]方法并加以改进，小鼠腹腔注射水合氯醛350 mg/kg麻醉，固定于脑立体定位仪上。头部皮肤常规碘酒、酒精消毒，沿颅骨中线切开约2 cm切口，确定囟门位置，囟门后0.5 mm、旁开1 mm距离移动微量进样器，进针3 mm，注入3 μL老化的Aβ25-35，2 min内缓慢注入侧脑室内，留针5 min，创口处涂抹青霉素钠粉，肌注青霉素钠注射液，鼠笼饲养，注意保暖。假手术组注入等量生理盐水。

2.2 分组及给药

手术后第2日，除假手术组外，其余小鼠按体质量随机分为模型组、盐酸多奈哌齐组（1.3 mg/kg）、参枝苓组（2.6 mL/kg）和温郁金低剂量组（6.0 mg/kg）、温郁金高剂量组（18.0 mg/kg），每组10只。各给药组给予相应药物灌胃，假手术组和模型组给予等量蒸馏水灌胃。给药体积为20 mL/kg，每日1次，连续15 d。

2.3 免疫组化检测小鼠tau蛋白磷酸化位点（Ser404和Thr231）的表达

末次给药后1 h，每组取小鼠6～7只，腹腔注射3.5%水合氯醛10 mL/kg麻醉，卧倒后剪开胸腔，暴露心脏，将输液针经心尖刺入左心室，右心耳处剪一小口，先用预冷生理盐水快速灌注，待右心房流出液体变透明时，将输液针连接至预冷的4%多聚甲醛，先快后慢灌注，直至肝脏发白、四肢及尾巴抽搐、僵硬时，断头取脑，4%多聚甲醛4 ℃固定，常规制作成5 μm厚的石蜡切片，常规脱蜡脱水，高压修复，5%BSA封闭，滴加一抗，4 ℃过夜，PBS洗涤后，滴加二抗，DAB显色，镜下观察。每只各取10张冠状切片，每张切片随机选取5个不同的视野，阳性结果为细胞内现棕黄色颗粒，用JEOA 801D形态学图像分析系统计算各组阳性细胞平均光密度值。

2.4 Western blot检测小鼠tau蛋白磷酸化位点（Ser404和Thr231）及PI3K/Akt蛋白表达

末次给药后1 h，每组取3只小鼠快速断头，冰上分离海马，称重。小鼠海马经蛋白裂解液裂取后提取总蛋白，BSA法测定蛋白浓度，10%凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭，一抗孵育，4 ℃静置过夜。PBS洗涤后加入二抗孵育，再次洗涤后加入超敏ECL化学发光试剂盒，借助凝胶成像系统观察相关蛋白的表达。用Quantity One 4.6.2图像分析软件进行分析。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析，多重比较采用Fisher's LSD。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果endprint

4.1 温郁金挥发油对小鼠海马组织tau蛋白磷酸化（Thr231和Ser404）表达的影响

与假手术组比较，模型组小鼠脑组织p-tau（Thr231和Ser404）蛋白阳性表达显著增加（P<0.05）；与模型组比较，温郁金高剂量组、盐酸多奈哌齐组、参枝苓组小鼠脑组织p-tau（Thr231和Ser404）蛋白阳性表达显著降低（P<0.05）。结果见图1、图2、表1。

4.2 温郁金挥发油对小鼠海马组织tau蛋白（Thr231和Ser404）、PI3K及Akt磷酸化表达的影响

与假手术组比较，模型组小鼠海马组织tau（Thr231和Ser404）磷酸化水平明显升高，PI3K和Akt磷酸化水平明显降低（P<0.05）；与模型组比较，温郁金高剂量组tau蛋白（Thr231和Ser404）磷酸化水平明显降低、PI3K和Akt磷酸化水平明显升高（P<0.05，P<0.01）。结果见表2、图3。

5 讨论

AD属中医学“呆证”范畴。虽病位在脑，但与肾关系密切，年迈者易肾精亏虚，致髓海空虚，神机失用而成痴呆。另一方面，人至暮年，脏腑虚衰，气血亏损，导致气虚血瘀；情志不畅，肝失疏泄，导致气滞血瘀，血瘀导致脏腑化生的气血不能充养元神之府，脑失所养而成痴呆。因此，中医把补肾益精、活血通络作为治疗AD的主要方法。有研究表明，以郁金为主要组分的方剂治疗AD，可明显改善AD患者的认知和日常生活能力[5]。提示郁金单独作用可能具有潜在的抗AD作用。

tau蛋白过度磷酸化是AD的主要病理特征之一，过度磷酸化的tau蛋白容易聚合形成不溶性纤维丝，进而对神经元形态、轴突的通信传导和物质运输等方面产生影响[6-7]，甚至造成神经元丢失，造成神经退行性病变。tau蛋白上与AD相关的磷酸化位点有Thr181、Thr231、Ser262、Ser199、Ser396和Ser404等。因此，检测tau蛋白在Thr231和Ser404等位点的磷酸化情况，可以反映AD的轻重程度。免疫组化结果显示，注射Aβ后，小鼠脑组织tau蛋白Thr231和Ser404位点过磷酸化的神经细胞明显增多，温郁金挥发油干预后，小鼠脑组织tau蛋白Thr231和Ser404位点过磷酸化的神经细胞明显减少，说明温郁金挥发油可以减少神经细胞中tau蛋白Thr231和Ser404位点的过磷酸化。

PI3K/Akt是细胞内重要的信号转导通路，具有调节葡萄糖转运、糖原及蛋白质合成与分解等多种细胞功能[8-9]。活化的PI3K/Akt通过磷酸化多种下游因子来调节细胞的生理过程[10]。Schubert M等[11]发现，PI3K/Akt信号传导不足将导致tau蛋白过度磷酸化，表明PI3K/Akt在调节tau蛋白磷酸化中起重要作用。本实验结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠脑组织PI3K和Akt的磷酸化水平降低，而tau蛋白（Thr231和Ser404）的磷酸化水平升高，可能的原因是Aβ抑制了PI3K/Akt信号通路的活性，Akt对tau蛋白激酶的抑制不足，使其活性增加，从而使tau蛋白的Thr231及Ser404位点磷酸化。温郁金挥发油干预后，小鼠脑组织PI3K和Akt磷酸化水平升高，而tau蛋白（Thr231和Ser404）磷酸化水平降低，表明温郁金挥发油降低Aβ致AD小鼠tau蛋白的磷酸化水平，推测其作用机制是激活PI3K/Akt信号通路，抑制tau蛋白激酶的活性，从而抑制其对tau蛋白的过度磷酸化。

综上，温郁金挥发油可降低AD模型小鼠海马区神经元tau蛋白Ser404和Thr231位点的过磷酸化，其机制可能与上调PI3K/Akt通路磷酸化水平有关。

参考文献：

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（收稿日期：2016-07-05）

（修回日期：2016-07-29；编辑：华强）endprint