一例肝豆状核变性家庭的ATP7B基因突变研究

赵龙国慧刘世国宋卫青

一例肝豆状核变性家庭的ATP7B基因突变研究

赵龙1国慧2刘世国3宋卫青1

目的 检测肝豆状核变性（Wilson Disease）患儿及其父母的ATP7B基因突变类型。方法 采用全基因组外显子测序技术（WES）对1例肝豆状核变性患儿及其父母ATP7B基因进行检测。结果 患儿母亲ATP7B-exon8基因发生了错义突变（c．2 333G＞T），导致p．R778L；患儿父亲ATP7B-exon11基因发生了错义突变（c．2 621C＞T），导致p．A874V。结论 患儿父母均为肝豆状核变性基因携带者。

肝豆状核变性；ATP7B基因；突变；测序分型

肝豆状核变性（Wilson Disease）又称威尔逊氏病，是一种遗传性铜代谢障碍所致的肝硬化和以基底节为主的脑部变性的常染色体隐性遗传的铜代谢障碍疾病。世界范围发病率为1/10万～1/3万[1]，杂合子频率为1/200～1/100[2]，其中中国是高发区，发病年龄多在5～35岁[3]，但报道经基因确诊的3～72岁均有[4-5]。该病是位于13q14.3的ATP7B基因突变所致，导致铜转运P型ATP酶缺失，从而导致血浆铜蓝蛋白降低及铜在体内器官的沉积等一系列临床表现。肝豆状核变性是目前少数可以治疗的神经遗传病之一，患者如果能在发病早期或症状前期即被确诊并得到及时治疗，大多预后良好，反之病情逐渐加重甚至危及生命。

1 资料与方法

1.1 一般资料

患儿，女，12岁，父母非近亲结婚。血清学检查结果显示血清铜蓝蛋白52 mg/L，23 h尿铜排泄量232 μg，影像学检查结果显示轻度肝硬化，脑MRI双侧豆状核呈对称性低密度阴影，诊断为肝豆状核变性。采集患儿及其父母外周静脉血5 ml，用于提取DNA。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 患者、患者父母分别采集静脉血10 ml，保存于抗凝管中。

1.2.2 基因组DNA提取 选用天根生化科技生产的DNA提取试剂盒，对该家庭3人采集静脉血进行基因组DNA提取。

1.2.3 外显子测序（WES） 对基因组DNA随机片段化制备cDNA文库。PCR扩增并纯化富集回收产物后，采用安捷伦人全外显子试剂盒特异性捕获外显子区域序列。使用安捷伦2100检测DNA样品的浓度和含量。在Illumina MISeq2000高通量测序平台对样品进行双向测序，并通过SOAPaligner2.20对比软件进行生物信息学分析，初步筛选高质量单核苷酸多态性（SNP）位点。

1.2.4 Sanger重测序验证 对于WES测序所检测到的突变结果在原标本中进行Sanger测序。来验证外显子测序结果的准确性。PCR突变所在的外显子，引物序列由青岛生工生物科技有限公司合成。 取扩增产物10 μl置于15 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，使用ABI70测序仪（Applied Biosystems）进行产物程序。采用DNAMAN软件进行生物信息学分析，并与GenBank中的ATP7B基因序列进行对比，判断是否为新突变位点。

2 结果

2.1 全基因组外显子测序

结果表明，患儿的父亲 ATP7B-exon11基因发生了错义突变（c.2 621C＞T），导致p.A874V；患儿的母亲ATP7B-exon8基因发生了错义突变（c.2 333G＞T），导致p.R778L。

2.2 Sanger测序验证

以PCR扩增为基础的Sanger测序也得到了与WES方法完全相同的突变。

3 讨论

肝豆状核变性广泛分布于各族群人种之间，通常发生于儿童和青少年期，少数成年期发病。若早发现早诊断早治疗，一般较少影响生活质量和生存期。铜代谢障碍是该病的主要特征之一。铜离子在体内异常沉积的速度、部位不同使得患者出现一个或多个器官功能损伤，随着病情的不断进展，可导致数个脏器不可逆的损伤，并出现各种并发症，危及患者生命。

传统临床上用于诊断肝豆状核变性的手段还比较单一，给临床诊治带来一定困扰。较多的肝豆状核变性的患者早期症状复杂多样，易被误诊为其他疾病如慢性肝炎、肝硬化、脾功能亢进、溶血性贫血等。而且铜代谢检查存在自身的局限性，假阴性假阳性结果较多。若能及早得到正确的诊断和治疗，大多数患者可恢复良好，且生活质量和寿命与正常人相似。

DNA测序技术是目前诊断肝豆状核变性最常用的基因检测方法，是该病基因诊断的标准。ATP7B基因全长约80 kb，由21个外显子和20个内含子组成[6]。基因长度为78 821 bp，大多数外显子的长度为200 bp左右。结构分析表明肝豆状核变性基因呈一个开放读码框，cDNA序列长度为4 233 bp，编码由1 411个氨基酸组成的P-型铜转运ATP酶。

随着基因测序技术的不断发展，及早确定ATP7B的基因突变类型，对于尽早明确诊断，及时做出干预有非常重要的意义，使机体早日免受器官损伤的风险。目前该基因以逐步作为产前诊断和新生儿筛查的指标[7]。然而ATP7B基因突变类型非常多，目前报道的ATP7B基因突变类型有550多种，以少数几个突变为主，存在明显的种族和地区差异[8]。这些突变大多是杂合突变，了解这些突变对基因检测至关重要。Kenney SM等[9]于2007年报道在肝豆状核变性的518种突变中，379种是致病的，139种为非致病性的，还有一些突变尚不能确定是否致病。

我们本次的研究仅有1例样本，对研究基因型与表现型的关系尚存在局限性。另外，阐明本地区ATP7B基因突变类型对于产前诊断和新生儿筛查非常重要，未来我们将收集更多患者资料，确定本地区肝豆状核变性基因变异的基础，并在此基础上进一步阐明ATP7B基因型与表现型的关系。

[1] Figus A，Angius A，Loudianos G，et al． Molecular pathology and haplotype analysis of Wilson disease in Mediterranean populations[J]．Am J Hum Genet，1995，57（6）：1318-1324．

[2] Als A，Walker AP，Ashkan K，et al． Wilson’s disease[J]． Lancet，2007，369（9559）：397-408．

[3] Roberts EA．Schisky ML． Division Gastroenterology and Nutrition． A practice guideline on Wilson disease[J]． Hepatology，2003，37（6）：1475-1492．

[4] Wilson DC，Phillips MJ，Cox DW，et al． Severe hepatic Wilson’s disease in preschool-aged children[J]． J Pediatr，2000，137（5）：719-722．

[5] 陈晶贞，孟艳燕． ATP7B蛋白在肝豆状核变性中的分子机制研究进展[J]． 临床和实验医学杂志，2008，7（8）：183-185．

[6] 陈定邦，冯黎，李洵桦． 肝豆状核变性的分子生物学研究进展[J]．分子诊断与治疗杂志，2011，3（2）：120-124．

[7] Roberts EA，Schilsky ML． Diagnosis and treatment of Wilson disease：an update[J]． Hepatology （Baltimore， Md），2010，47（6）：2089-2111．

[8] 张秀海，刘伟． 肝豆状核变性的遗传学研究及治疗进展[J]． 临床医学，2008，28（11）：109-111．

[9] Kenney SM，Cox DW． Sequence variation database for the Wilson disease copper transporter，ATP7B [J]． Hum Mutat，2007，28（12）：1171-1177．

Study on ATP7B Gene Mutation in a Family With Wilson Disease

ZHAO Long1GUO Hui2LIU Shiguo3SONG Weiqing11 Medical College of Qingdao University, Qingdao Shandong 266003, China; 2 International Clinic, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao Shandong 266003, China; 3 Prenatal Diagnosis Center, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao Shandong 266003, China

ObjectiveTo investigate the type of ATP7B mutation in a child with Wilson disease and her parents.MethodsUsing whole-genome exon Sequencing(WES) to detect ATP7B gene in one patient with Wilson's disease and her parents.ResultsMissense mutations (c.2 333G＞T) in ATP7B-exon8 gene occurred in patient’s mother, which lead to p.R778L;Missense mutations (c.2 621C＞T) in ATP7B-exon8 gene occurred in patient’sfather, which lead to p.A874V.ConclusionPatient’s parents are Wilson disease gene carriers.

wilson disease; ATP7B gene; mutation; multilocussequence typing

R446．6

A

1674-9316（2017）06-0090-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．06．054

1 青岛大学医学部，山东 青岛 266003；2 青岛大学附属青岛市市立医院国际门诊，山东 青岛 266003；3 青岛大学医学院附属医院产前诊断中心，山东 青岛 266003

宋卫青