铜绿假单胞菌发酵产鼠李糖脂生物表面活性剂的方式及条件研究

巩志金，车程川，杨 革，刘金锋，梁光杰，梁鑫鑫，刘胜格

（曲阜师范大学 生命科学学院，山东 曲阜 273165）

铜绿假单胞菌发酵产鼠李糖脂生物表面活性剂的方式及条件研究

巩志金，车程川，杨 革，刘金锋，梁光杰，梁鑫鑫，刘胜格

（曲阜师范大学 生命科学学院，山东 曲阜 273165）

该文综述了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生成鼠李糖脂的相关发酵技术的研究概况，包括液态发酵、半固态发酵和固态发酵等。重点介绍了影响液态发酵的相关因素，如碳源、氮源、无机盐、温度、pH、消泡方法及分批补料发酵等的研究现状，以期为今后利用铜绿假单胞菌发酵生产鼠李糖脂生物表面活性剂提供研究思路和技术参考。

铜绿假单胞菌；鼠李糖脂；发酵；生物表面活性剂

表面活性剂具有增加润湿性、乳化性、起泡性等优良性能，是日常生活和工业生产中重要的化工原料，素有“工业味精”之称[1]。生物表面活性剂是微生物次级代谢产生的新型表面活性剂，其化学结构一般包括由酸类、离子肽类及糖类等物质组成的亲水基团和由饱和或不饱和的脂肪链或脂肪酸组成的疏水基团，如脂肪酸、脂多糖、磷脂及脂蛋白质等[2-4]。与传统化学合成的表面活性剂相比，生物表面活性剂具有无毒、可再生、易生物降解等优势，在石油化工、环境工程、生物医药和农业生产等领域具有巨大的应用潜力，市场前景广阔。如20世纪90年代在美国阿拉斯加发生的油船漏油事故中，通过向海面油层中加入了生物表面活性剂生产菌，几周后油污中所含正烷烃基本被消耗掉[5]。

鼠李糖脂（rhamnolipid）是目前研究最深入、应用最广泛的一种生物表面活性剂，其亲水基团一般由1～2分子的鼠李糖环构成，疏水基团则由不同碳链长度的β-羟基烷酸构成[6]。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是自然环境中常见的革兰氏阴性细菌[7]，由于其卓越的生产能力，已经成为鼠李糖脂发酵的主要生产菌株，也是唯一实现工业化的菌株。目前，通常采用铜绿假单胞菌液态发酵技术生产鼠李糖脂。发酵过程受培养基组分及培养条件等的影响，并存在一些诸如发酵过程中起泡严重等无法有效解决的技术问题。近年来也有研究者尝试采用半固态发酵[8]或固态发酵[9-10]的方式生产鼠李糖脂，以期更好的解决鼠李糖脂发酵过程中存在的问题。

本文拟从目前研究最深入、技术最成熟的铜绿假单胞菌发酵产鼠李糖脂为切入点，以液态发酵、半固态发酵和固态发酵3种鼠李糖脂发酵技术为线索，整理国内外相关的研究报道、总结相关发酵条件并分析存在的技术问题，以期为改进鼠李糖脂的生产工艺和提高鼠李糖脂的发酵生产水平提供技术参考。

1 液态发酵生成鼠李糖脂

从1949年JARVIS F G等[11]通过液态发酵首次获得鼠李糖脂以来，经过几十年的发展，液态发酵已经成为鼠李糖脂生产的主要技术，也是目前唯一实现鼠李糖脂工业化生产的发酵技术。铜绿假单胞菌液态发酵生产鼠李糖脂受培养基组分和培养条件的影响，准确的掌握各影响因素及合理的选择发酵条件可以有效的提高鼠李糖脂的发酵产量，降低生产成本。

1.1 碳源

碳源可为微生物生长和产物合成提供所需的碳架和能量，是菌体生长和产物代谢的主要营养物质。铜绿假单胞菌可以利用的碳源非常广泛（如亲水性的甘油、葡萄糖和乙醇等[12-13]及疏水性的石蜡、烷烃和植物油等[14]）。此外，还有研究者为了降低原料成本、增加鼠李糖脂的经济性，选择利用廉价的工业废弃物（如糖蜜废水[15]和豆油炼油厂废弃物[16]等）作为发酵的碳源。

一般来说在铜绿假单胞菌可利用的众多种碳源中，疏水性碳源特别是以植物油为代表的脂类碳源比亲水性碳源更适合用于鼠李糖脂的发酵。其原因可能是当以植物油等疏水性碳源为底物时，铜绿假单胞菌为了利用这类底物需要产生具有一定的表面活性物质来增加其溶解度，从而促进了鼠李糖脂的生成[17]。因此，在铜绿假单胞菌发酵生产鼠李糖脂的研究中，多以植物油作为发酵的碳源。目前，国际上鼠李糖脂分批发酵的最高产量的报道是GIANI C等[18]以豆油为主要碳源并采取氮源限制的方法得到112g/L的鼠李糖脂。ZHU L等[19]也是以豆油为主要碳源得到70.56 g/L的鼠李糖脂。

1.2 氮源

培养基中的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。铜绿假单胞菌可利用蛋白胨、尿素、硝酸钠和硫酸铵等多种氮源合成鼠李糖脂，但大多数的研究表明，硝酸钠为最适的发酵氮源[20-21]。这其中的原因可能是以硝酸钠为氮源时，鼠李糖基转移酶基因（rhlAB）的表达量明显高于硫酸铵等其他氮源[22]，或者是高浓度的NH4+等会降低细胞中谷氨酰胺的浓度，从而影响鼠李糖脂的合成[23]。

发酵培养基中氮源的含量对调节菌体代谢和产物生成具有重要作用。研究表明，鼠李糖脂是一种在菌体生长稳定期才大量合成的次级代谢产物，氮源过量会导致菌体生长过于迅速从而影响产物的生成。因此，在发酵过程中通常会采用限制氮源的发酵方式来提高鼠李糖脂的产量。如ARINO S等[21]考察了氮源过量和控制氮源两种培养条件对鼠李糖脂发酵的影响，发现氮源过量时菌株生长迅速，在35h时就达到峰值并停止增长，鼠李糖脂产量为2.1g/L；在限制氮源的条件下菌体生长相对缓慢，至50 h才停止生长，鼠李糖脂的产量达到5.8 g/L。MARKUS M M等[24]以铜绿假单胞菌PAO1为生产菌株，并控制硝酸钠的质量浓度为1.5 g/L，得到了36.7 g/L的鼠李糖脂产量。

另外，培养基中的碳源和氮源的比例（C/N）对鼠李糖脂的发酵也有重要影响，合理的优化培养基中C/N可以有效提高鼠李糖脂的发酵产量。LUIS G S等[20]评价了C/N为8～30时的鼠李糖脂发酵情况，发现当C/N为18时鼠李糖脂的产量最高，当C/N低至9时生物量和产量会随之减少。RAMANA K V等[25]发现当以硝酸钠、硫酸铵和硝酸铵为氮源时，C/N处于低水平时均有利于菌体生长但不利于鼠李糖脂生产，而当C/N逐渐升高至38时鼠李糖脂的产量也都逐渐增加并达到最大。

1.3 无机盐

发酵培养基中除碳源和氮源外，无机盐元素如镁铁磷等也对铜绿假单胞菌发酵生成鼠李糖脂有较大影响，并且伴有低浓度时促进、高浓度时抑制鼠李糖脂合成的现象。如LUIS G S等[20]发现鼠李糖脂的产量会随着碳元素与铁离子质量比（C/Fe）的增大而逐渐升高，但却基本不受钾离子、钙离子和钠离子的影响；镁离子在低浓度时比高浓度时更有利于鼠李糖脂的合成[26]。RAMANA K V等[25]也通过实验证明了低浓度的镁离子对发酵具有促进作用，高浓度时有抑制作用。但是，却发现无铁离子的培养基中鼠李糖脂的产量要明显高于有铁离子的培养基，这与LUIS G S等[20]报道的现象正好相反。这可能是由于实验中所使用的菌株或培养基的差异造成的。

此外，CATHERINE N M等[27]的研究表明限制磷酸盐的蛋白胨/葡萄糖/铵盐培养基（phosphate-limited proteose peptone glucose ammonium saltsmedium，PPGAS）中鼠李糖脂的产量明显高于磷含量较高的磷酸盐基础培养基和磷酸盐肉汤培养基，说明低浓度的磷可促进鼠李糖脂的合成，高浓度的磷则具有抑制作用。

1.4 pH

pH可对微生物培养环境中的细胞膜的透性、膜上的带电性以及酶活性等产生影响，从而影响发酵生产。根据相关文献报道，在鼠李糖脂的发酵过程中合理的控制培养基的pH值可有效的提高产物的产量。有研究者以葡萄糖为碳源，考察了pH5.75～7.50范围内对发酵的影响。发现鼠李糖脂发酵最适pH值为6.25，高于这个值时鼠李糖脂产量和菌体浓度均下降，而低于pH 5.75时则很难保持恒定的培养状态无法进行恒化培养[26]。还有研究者发现当起始pH值为6～7时鼠李糖脂的产量较高且基本不变，但是高于或低于这个范围时鼠李糖脂产量明显下降[21]。

通常人们会根据菌株和培养基组分的差异，将培养基的起始pH值控制在6～7之间来提高发酵的产量。如CHEN S Y等[28]在分批发酵和补料连续发酵中均将发酵pH值控制在6.8，得到了理想的发酵结果。此外，ZHU L等[19]还认为根据菌体生长代谢的需要在不同生长阶段分别控制发酵的pH，将有助于提高发酵的产量。将接种初期（0～24 h）的pH值控制在有助于菌体生长的中性偏碱的范围（7.0～7.5），发酵中后期（24 h后）的pH值控制在有利于鼠李糖脂合成的中性偏酸的生长环境（6.0～6.5），最终得到了28.8 g/L的鼠李糖脂产量。这与未采取分段控制pH的分批发酵方式相比，产量提高了19.7%[19]。

1.5 温度

铜绿假单胞菌可在多种温度条件下合成鼠李糖脂，但最适发酵温度一般为30～37℃。低至28℃或高于39℃时，菌体的生长和产物的生成都会受到较大影响[26]。目前在鼠李糖脂的发酵研究中，人们通常会根据培养体系和菌株的差异选择30℃或37℃作为发酵的温度。如MARKUS M M等[24]在对目前已报道的3种非常优异的鼠李糖脂生产菌—铜绿假单胞菌PAO1、DSM 7108和DSM 2874进行了评价时，所选的发酵温度即为30℃和37℃。

1.6 消泡

铜绿假单胞菌液态发酵生产鼠李糖脂是一个好氧过程，发酵过程中大量的通气和快速搅拌会导致起泡严重，不利于发酵生产。传统的消泡方式如流加消泡剂和机械消泡等，仅适用于鼠李糖脂产量较低的发酵过程，当产量较高时则无法满足消泡要求。为此，THITIMA S等[29]开发了发酵偶联泡沫分离的消泡技术，实现了鼠李糖脂的边发酵边泡沫分离。但是泡沫被分离液化后会含有大量的菌体和未利用的培养基，既浪费了发酵基质又增加了后续鼠李糖脂分离纯化的难度，不利于鼠李糖脂的发酵生产。CHAWALAC等[30]为了避免在鼠李糖脂发酵过程中进行大量通气和快速搅拌，提出了一种在厌氧状态下进行鼠李糖脂生物合成的全新策略，通过铜绿假单胞菌ATCC10145实现了鼠李糖脂的厌氧发酵，并优化了培养基中碳、氮、磷、硫、镁、钙和铁等离子的浓度得到了在厌氧条件下进行鼠李糖脂发酵的最佳培养基配方，实现了鼠李糖脂的无泡沫产生。但是，目前该技术得到的鼠李糖脂产量还较低，仅为好氧发酵的1/3，限制了其进一步的应用。

曾报道一种采用在发酵罐排气口处连接一个用于收集和液化泡沫的储罐的方式，可有效解决鼠李糖脂的消泡问题[31]，具体的方法是将发酵产生的泡沫经尾气出口进入储罐，并在储罐内进行液化，液化后的发酵液可被重新泵入发酵罐进行再次发酵。采用该发酵技术不仅减少了在消泡过程中造成的发酵基质损失，也可在储罐上安装消泡剂喷淋或压力控制装置等进行辅助消泡，是目前鼠李糖脂发酵中最有效的消泡方法。但是，这种发酵方式还不能解决发酵罐内部起泡的问题，无法对起泡后的发酵过程进行有效的监测和调控，仍需要进一步优化和改进。

1.7 补料分批发酵

补料分批发酵工艺可以使微生物在低浓度底物条件下持续发酵并可对产物进行一定的稀释，有利于解除底物抑制和代谢产物阻遏等问题。但经研究者调查发现，对铜绿假单胞菌进行补料分批发酵的效果并不明显（分批发酵鼠李糖脂产量范围为6～112g/L，补料分批发酵为5～95g/L）。造成这种现象的原因可能是鼠李糖脂的发酵生产规律比较复杂，人们对此还缺乏理解[32]。此外，大多数高产的分批发酵都采用了较高浓度的植物油作为碳源，说明铜绿假单胞菌可在高初始油浓度的培养基中正常生长和代谢，不存在明显的底物抑制现象。因此，有时单纯通过补料来提高发酵的水平并不理想，还需要辅以其他调控方式来提高产量。如ZHU L等[19]通过在补料发酵中辅以分段控制pH的方式得到70.56 g/L的鼠李糖脂产量，比相同条件下的分批发酵产量提高了193%。

2 半固态发酵生成鼠李糖脂

半固态发酵是指在基质中含有部分游离水的体系中进行的发酵，一般常用于酿酒、泡菜等传统酿造食品的生产中，在鼠李糖脂发酵中的报道较少[33-34]。王盼盼等[8]以菜籽粕和麸皮为固相载体、甘油为碳源，采用半固态发酵的方式得到18.7g/L的鼠李糖脂，并且乳化系数要高于同等条件下液态发酵的鼠李糖脂。半固态发酵所使用的固相载体一般为廉价的农业废弃物，会导致发酵液中存在大量的固相载体及其浸出物，增加了后续分离纯化的困难，不利于鼠李糖脂的提取纯化。但是，半固态发酵法生产鼠李糖脂也有一定的存在价值，如采用廉价的农业废弃物作为发酵的固相载体，既降低了原料成本又在一定程度上减少了泡沫的产生，增加了鼠李糖脂的经济性。此外，半固态发酵得到的鼠李糖脂在土壤修复、生物农药及叶面肥料等鼠李糖脂纯度要求较低的领域也具有一定的应用潜力。

3 固态发酵生成鼠李糖脂

固态发酵是指在基质中不含有游离水的体系中进行的发酵，是一种发展已久的发酵技术。可是随着大规模深层液态发酵技术的广泛应用和巨大成功，固态发酵逐渐被人们忽视了。但是与液态深层发酵相比，固态发酵仍具有一些自身的优势，如对基质要求低、设备占用空间小、通气状况良好和无需快速搅拌等。因此，为避免液态发酵起泡严重的问题，人们开始考虑利用固态发酵技术来生产鼠李糖脂。如DOUMIT C N等[9]以铜绿假单胞菌UFPEDA 614为生产菌株，利用甘蔗渣为固相载体进行鼠李糖脂的固态发酵得到了46 g/L的鼠李糖脂，并且整个发酵过程中无泡沫产生，后来通过进一步的优化，得到了一种更低成本的鼠李糖脂固态发酵工艺，提高了固态发酵生产鼠李糖脂的经济性[10]。此外，NALINI S等[35-36]也采用固态发酵技术成功的得到了鼠李糖脂。

目前对于固态发酵生产鼠李糖脂的研究较少，仅限于摇瓶发酵报道，而且鼠李糖脂产量相对较低、产物中杂质多、提纯困难，再加上大规模固态发酵罐生产自身的技术问题，要实现鼠李糖脂的固态发酵生产还有很长的路要走。但是利用固态发酵技术生产鼠李糖脂为当前鼠李糖脂的发酵生产提供了另一种研究思路，具有一定的参考价值。

4 问题与展望

经过几十年的研究，人们对铜绿假单胞菌发酵生产鼠李糖脂的认识已经越来越全面，并且实现了一定规模的工业化生产。但是仍然存在着发酵生产效率较低、原料的成本过高、下游的提纯工艺复杂且昂贵等诸多问题，导致其在经济上与廉价的化学合成的表面活性剂相比不占优势，限制了鼠李糖脂工业的进一步发展。为此，今后可在以下几方面继续加强研究：

（1）提高发酵生产的效率。加强铜绿假单胞菌的遗传学研究，通过基因工程手段改良菌种，从而从源头上提高发酵生产的效率；改进发酵工艺，解决诸如起泡严重带来的生产问题，提高设备利用率。

（2）降低原料成本。寻找廉价的可替代原料为底物，改变现有的普遍以昂贵植物油为碳源的发酵现状，对发酵培养基进行优化和复配，减少昂贵培养基组分的用量，降低生产成本。

（3）改进下游提纯工艺。整合优化现有的提取方法，探索高效、简便的提纯工艺，并建立有效的废液回收机制，降低生产成本。

（4）加快鼠李糖脂的应用研究，拓展应用范围。鼠李糖脂生物表面活性剂作为一种新型的表面活性剂，其应用研究还处于起步阶段，许多应用领域还待开发，很多应用技术还待完善。所以应重视并加快鼠李糖脂的应用研究，拓展应用范围，增加市场需求。通过市场需求带动鼠李糖脂相关产业的全面发展，近而反哺和推动相关技术的进步。

总之，随着社会的进步和人们环保意识的增强，21世纪的表面活性剂正朝着安全、温和及易生物降解的方向发展，以鼠李糖脂为代表的生物表面活性剂将会拥有更加广阔的市场前景。铜绿假单胞菌发酵生产鼠李糖脂的研究，也将会迎来新的高速发展期。

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Fermentation method and condition of rhamnolipid biosurfactant byPseudomonas aeruginosa

GONG Zhijin,CHE Chengchuan,YANG Ge,LIU Jinfeng,LIANG Guangjie,LIANG Xinxin,LIU Shengge
(College of Life Science,Qufu Normal University,Qufu 273165,China)

Fermentation technology of rhamnolipid was reviewed byPseudomonas aeruginosain this paper,including liquid-state fermentation,semi-solid state fermentation and solid-state fermentation.In addition,influencing factors were specially summarized in liquid-state fermentation,such as carbon source,nitrogen source,inorganic salt,temperature,pH,defoaming method and batch-fed fermentation,which could provide a good idea and reference for the fermentation of rhamnolipid biosurfactant byPseudomonas aeruginosa.

Pseudomonas aeruginosa;rhamnolipid;fermentation;biosurfactant

Q93

0254-5071（2017）10-0130-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.027

2017-08-10

国家级“本科教学工程”专业综合改革试点（ZG0293）；高校应用型人才培养专业发展支持计划（鲁教高字[2015]5号）；曲阜师范大学科技计划（xkj201610）

巩志金（1988-），男，助理实验师，硕士，研究方向为代谢与发酵工程。