酵母菌高糖耐受机制的研究进展

毕新煜，刘功良，2*，姜弘佳，余洁瑜，卓燕颖，许琦祺，白卫东，2

（1.仲恺农业工程学院 轻工食品学院，广东 广州 510225；2.广州市广式传统食品加工与安全控制重点实验室，广东 广州 510225）

酵母菌高糖耐受机制的研究进展

毕新煜1，刘功良1，2*，姜弘佳1，余洁瑜1，卓燕颖1，许琦祺1，白卫东1，2

（1.仲恺农业工程学院 轻工食品学院，广东 广州 510225；2.广州市广式传统食品加工与安全控制重点实验室，广东 广州 510225）

在酒精浓醪发酵生产中，酵母菌在高糖度、高渗透压等恶劣环境下发酵产生乙醇的性能与其耐受机制有密切的联系。该文以酵母菌高糖耐受机制为切入点，介绍了耐高糖酵母菌的来源，高糖胁迫下酵母菌的应激反应，归纳已公开报道的与酵母菌高糖耐受机制可能有关的基因，借鉴真菌及细菌在转录组学与蛋白质组学水平上耐受性能及机制的研究，为基因水平上酵母菌高糖耐受机制的相关研究提供参考。

耐高糖酵母；耐受机制；基因；转录组学；蛋白质组学

近年来，在极端微生物的研究中，耐高糖酵母菌[1]已经引起了人们的广泛关注。耐高糖酵母菌是能够在高浓度糖的环境中生长、发酵并产生乙醇（C2H5OH）和二氧化碳（CO2）的真菌，对酒精浓醪发酵的工业的生产具有重要价值[2]。目前，国内外对耐高糖酵母菌的研究还处在菌种的驯化和选育、性能研究等阶段[3]，对其高糖耐受机制的研究也在逐渐深入。耐高糖酵母菌的筛选是研究其高糖耐受机制的前提，酵母菌高糖耐受机制的研究目前仅仅是突破至分子水平，同时还存在一定的局限性，若能借助基因组、转录组和蛋白质组的相关技术及研究，将能够深入地揭示或阐述其高糖耐受性的本质，这对酵母菌的定向改造以及酒精浓醪发酵具有重要意义[4-5]。

当前，酵母菌耐受高糖机制的研究主要包括高糖胁迫应激代谢产物、高糖胁迫的氧化应激、高糖耐受性能的基因三个方面[6]。酵母菌耐高糖机制研究大多限于分子水平，若能通过一株耐高糖酵母找出其与高糖耐受性能有关的基因，并对非耐高糖酵母进行定向改造，将会更有切合酒精浓醪发酵工业生产的需要，同时，也能简化耐高糖酵母的筛选步骤，并进一步揭示酵母菌耐受高糖的本质[7]。

1 耐高糖酵母菌的来源

1.1 自然选育

自然选育是获得耐高糖酵母的途径之一，取材于自然，来源广泛，在蜂巢、蜂蜜、甘蔗、高糖果酒、果汁等样品中均有发现。从样品中筛选较理想生产菌种的一般步骤：采集菌样→富集培养→菌种分离→性能鉴定[8]。

杜鹃等[9-10]以东北椴树蜜为原料，通过分离纯化得到酵母菌，运用高糖平板分离培养基进行初筛，然后通过耐糖能力测试对酵母菌进行复筛，最终获得酵母菌YMI-37，能在葡萄糖含量80%的高糖环境中生长，还具有起酵速度快、发酵能力强的特性。根据分子生物学的鉴定结果显示为酵母菌属的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

LIU G L等[11]从蜂蜜厂收集了17份陈旧蜂蜜样品，通过富集培养、梯度平板稀释及多次传代，分离得到6株耐高糖酵母菌，经过26S rDNA基因测序分析鉴定均为酵母菌属的蜂蜜接合酵母（Zygosaecharomyces mellis）。采用杜氏管发酵法测定各菌株的糖耐受性、酒精耐受性、酸耐受性，并进行高糖浓度条件下的酒精发酵实验。结果显示，6株菌的耐受糖浓度范围为50%～70%，耐酒精度范围为10%vol～12%vol，可耐受pH 2.5～4.5的酸性环境。其中菌株6-7431的抗逆性能最好，耐受的最高糖浓度为70%，耐受的最高酒精度为12%vol，耐受的最低pH值为2.5，筛选出的各菌株在高糖环境中均能发酵产生酒精。

1.2 诱变育种

在发酵工业中，诱变育种是选育大多数优良高产菌株使用的方法[12]。在人工诱变基因突变的基础上进行的，是微生物育种的主要方法之一，现今的工业生产也是普遍使用。

赵硕等[13-14]采用驯化和紫外诱变的方法，以酵母菌株作为出发菌株，进行耐高糖酵母菌株的筛选，最终确定最佳紫外诱变条件为：15 W紫外灯，照射距离20 cm，照射时间40 s。在此条件下，成功筛选出2株在65%的高糖环境下仍能起酵的目的菌株。

2 高糖胁迫应激反应的研究

在高糖胁迫条件下酵母菌主要的应激代谢产物甘油和海藻糖的含量有所改变，同时细胞也会通过主动调节胞内物质的浓度和酶活力来适应这种高糖环境。

彭郦等[15]以鲜榨荔枝汁为原料，通过发酵培养基葡萄糖质量浓度的改变（180～400 g/L），考察酿酒酵母AWRI R2在高渗透压环境中生长及胞内海藻糖代谢情况。结果显示该酿酒酵母在300 g/L高葡萄糖质量浓度下能够良好生长，胞内海藻糖的含量随着初始糖浓度的增加而迅速增加，当葡萄糖质量浓度为400 g/L时，胞内海藻糖积累量达48.73 mg/g（湿质量）。李晓军等[16]研究了酿酒酵母FCC2146在30%高糖环境下指数生长期的生理代谢，结果表明，甘油质量浓度较对照组提高了400%、海藻糖质量浓度和胞外酒精质量浓度分别提高11%和100%，酿酒酵母的主要相容性溶质为海藻糖[17]和甘油。

张穗生等[18]从甘蔗糖厂的废弃物中筛选获得一株野生型酿酒酵母MF1002，通过紫外突变获得糖分利用能力较高的呼吸突变高产菌株MF11a。在葡萄糖含量为30%和40%的培养条件下，菌株MF1002生长和乙醇发酵受到明显抑制，菌株MF11a的最大菌体数目、最高出芽率和乙醇发酵浓度等均显著高于菌株MF1002。其中，在30%葡萄糖含量的胁迫培养条件下，菌株MF11a的胞内超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）活力、胞内过氧化物酶活力、细胞质三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase，ATPase）活力和线粒体ATP酶活力的上升幅度显著。表明这3种酶活力可能与菌株MF11a的高糖耐受能力有关，可作为该菌株进一步改造的指导指标。

3 与酵母菌高糖耐受机制可能有关的基因

酵母菌高糖耐受性能应该会受到某些基因的调控，但目前尚未有明确结论或突破性的进展。因此，可以从酵母菌代谢过程中的部分关键基因出发，进一步深入探讨。

GPD2基因是工业酿酒酵母甘油合成途径的关键基因，黄广庆[19]通过构建缺失GPD2基因的单倍体和二倍体突变酵母菌，再与各自所对应的出发菌株的比较中发现，副产物中甘油和乙酸等的产量有所下降，同时乙醇的获得率有明显提高，但是菌株的生长状况受到较大影响，葡萄糖的消耗速率变慢，发酵周期有所延长。张国英[20]以工业酿酒酵母（S.cerevisiae）Y为出发菌株，使用电击转化的方法获得重组菌。利用酵母双杂交技术，分别将两种菌进行群体杂交，通过聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）的方法和产孢法，对全突变掉GPD1和GPD2基因的双倍体菌株进行分别鉴定。以葡萄糖为底物的发酵实验表明，两种重组菌分别与对应的宿主菌比较，重组菌的生长速率比宿主菌缓慢，甘油产量较宿主菌明显下降了，但酒精产量都显著提高。发酵的次要副产物，丙酮酸和乙酸的产量都有所减少。

孟刚等[21]在乙酸代谢途径中通过敲除具有乙酸激酶活性的tdc D基因控制乙酸溢流，通过糖含量的改变（“高糖”和“微糖”），探究乙酸含量的变化以及对发酵的影响。结果显示，tdc D基因缺失菌能够适应更灵活的残糖控制范围，在“高糖”控制条件下，tdc D基因缺失菌株在对数生长后期能够保持较高的生长速率和产酸效率。乙酸产量为比对照菌降低了64.72%，色氨酸产量为比对照菌提高了54.88%。

陈小玲等[22]通过敲除野生型工业酿酒酵母MF1015菌株的Mbp1基因，分析二者在乙醇耐受性、耐热性、细胞壁完整性、呼吸强度、海藻糖含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、过氧化物酶、乙醇脱氢酶活性等方面的差异。结果表明，在含刚果红或十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）的平板上突变菌株的菌落比野生型小、菌体存活率低；突变菌株的乙醇耐受性和耐热性均下降，在乙醇体积分数为9%的液体培养基中，突变菌株的最大OD600nm值约为3.15，而野生型最大OD600nm值约为3.48；40℃时，突变菌株最大OD600nm约为3.0，而野生型约为4.5；用体积分数9%的乙醇处理后，突变菌株胞内海藻糖含量、过氧化物酶、SOD、过氧化氢酶、乙醇脱氢酶酶活分别比野生型低49%、80%、24%、37%、73%，而未经乙醇处理的突变菌株和野生型酶活无明显差别。推测Mbp1基因有助于工业酿酒酵母适应外部不良环境。

4 酵母菌耐受高糖机制的转录组学和蛋白质组学研究

酵母的耐受性存在千丝万缕的联系，受到很多因素的综合影响，是较复杂的调控系统[23]，通过对某个单一基因的敲除或者过表达来有效地提高酵母的耐受性不一定能得到很好的效果[24]。随着基因组学、蛋白质组学等技术的发展，也可以从综合和整体的角度来研究酵母菌的耐受性机制[25]。

彭素琴等[26]以一株产酱香地衣芽孢杆菌CGMCC3963和不产酱香的模式菌株ATCC14580为研究对象，测定其耐高渗、耐酸和耐乙醇的特征，利用转录组学研究分析菌株CGMCC3963的耐受机制。转录组比较分析表明，二者的一系列与耐受相关的基因表达有差异。乙醇脱氢酶、编码Ⅱ类休克蛋白、氧化应激、pH动态平衡等相关基因的差异表达，在提高菌株耐受酸性环境能力上起了重要作用，Ⅱ类和Ⅲ类热休克基因的高表达对菌株CGMCC3963耐乙醇能力起了决定性作用。

叶美玲[27]应用转录组测序技术对南极酵母AN5正常生长和铜离子处理条件下的转录组进行测序，将测序数据进行整理分析、筛选相关差异基因、对差异基因进行功能注释和分析。利用定量聚合酶链反应（quantitativepolumerase chain reaction，qPCR）技术研究南极酵母AN5重金属胁迫下基因的表达情况，从差异基因中筛选了3个基因进行验证。在铜离子胁迫下，重复蛋白基因的表达量均有不同程度的上调，说明这两个基因很可能与南极酵母AN5的重金属抗性机制有关。

谢梦琴等[28]将正常组培养的鲁氏接合酵母和高盐培养的鲁氏接合酵母，通过双向电泳技术[29]分离样品中的蛋白，通过生物信息软件对电泳图进行分析，实验结果显示，蛋白点差异＞1.5的点有63个，其中34个下调，29个上调，成功的找出其中蛋白点差异＞3的点有10个，从而分析高盐环境对鲁氏接合酵母的影响。

张雪[30]以石耳地衣真菌为研究对象，使用聚乙二醇对其进行干旱胁迫诱导后，提取蛋白，通过蛋白质双向电泳及质谱技术结合的方法，在蛋白质组学水平上对石耳地衣真菌的抗旱分子机制进行了研究。然后通过对差异蛋白质组比较分析，共鉴定出136个在干旱胁迫下蛋白质丰度变化达到2倍以上的蛋白。通过数据库查询，对所鉴定出来的蛋白点的相对分子质量、等电点、细胞内定位以及蛋白功能等信息进行分析[31]。结果发现在聚乙二醇诱导胁迫下，蛋白丰度发生较大变化的蛋白主要是与线粒体、核糖体、分子伴侣等相关的蛋白，说明当石耳地衣处于干旱胁迫时，石耳地衣真菌能够通过调节其能量代谢、蛋白质合成和折叠过程适应外界环境的变化[32]。

5 结论与展望

随着分子生物学与基因工程的迅速发展[33]，基因组学、转录组学和蛋白质组学的相关技术与积累[34]，可为酵母菌高糖耐受机制的深入研究提供新的思路，相关工作可从以下三个方面开展：（1）单菌基因组测序与比较，通过生物信息软件对耐高糖酵母菌与普通酵母菌序列中不同的部分进行基因功能注释；（2）通过RNA-Seq高通量测序技术[35]，在RNA层次分析其高糖耐受机制；（3）在蛋白质的水平上分析其高糖耐受机制。

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Research progress on high sugar tolerance mechanism of yeast

B
I Xinyu1,LIU Gongliang1,2*,JIANG Hongjia1,YU Jieyu1,ZHUO Yanying1,XU Qiqi1,BAI Weidong1,2
(1.College of Light Industry and Food,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China;2.Key Laboratory of Traditional Cantonese Processing and Safely Control,Guangzhou 510225,China)

In the thick mash fermentation of alcohol production,the performance of yeast producing ethanol under the severe environment(such as high sugar,high osmotic pressure)and its tolerance mechanisms were closely connected.Based on sugar tolerance mechanism of yeast as the breakthrough point,the paper introduced the source of the high sugar tolerant yeast,the stress response of yeast under high sugar stress,the genes reported that may related to high sugar tolerance resistance were summarized.Taking the research of fungi and bacteria tolerance performance and mechanism in the transcriptomics and proteomics level as reference,it provided references for the study of high sugar tolerance mechanism of yeast on gene level.Key words：high sugar tolerant yeast;tolerance mechanism;gene;transcriptomics;proteomics

TS261.1

0254-5071（2017）10-0001-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.001

2017-07-18

广东省高等学校优秀青年教师培养计划项目（YQ2015094）；广东省联合培养研究生示范基地项目（粤教研函[2016]39号）；广州市科技计划项目（201509010005）；广州市产学研协同创新重大专项（201604020001）；广东省省级大学生创新创业训练计划项目（201711347039）；广东省校级大学生创新创业训练计划项目（201711347123）

毕新煜（1993-），男，硕士研究生，研究方向为发酵工程。

*通讯作者：刘功良（1980-），男，副教授，博士，研究方向为发酵工程。