PM2.5对大鼠气管上皮细胞氧化应激及自噬的影响*

李东繁，杜旭升，刘 安

西安市中心医院呼吸科(西安 710003)



·基础研究·

PM2.5对大鼠气管上皮细胞氧化应激及自噬的影响*

李东繁，杜旭升，刘 安

西安市中心医院呼吸科(西安 710003)

目的：探讨PM2.5对RTE大鼠气管上皮细胞的氧化应激及自噬的影响。方法：采集制备不同浓度的PM2.5来处理RTE细胞，用MTT比色法测定细胞增值率，流式细胞术检测细胞内活性氧类(ROS)自由基生成，Western Blot检测微管相关蛋白1轻链3 I蛋白(LC3I)和LC3II表达。结果：PM2.5100 mg/L和200 mg/L处理后细胞存活率均明显降低，并呈浓度和时间依赖性。不同浓度PM2.5可升高胞内ROS水平及增加LC3 II蛋白表达，亦呈浓度和时间依赖性。结论：PM2.5通过诱发氧化应激及自噬对气道上皮起到损害作用，其中氧化应激促进细胞过度自噬的发生。

近年来，以慢性阻塞性肺疾病为代表的呼吸系统疾病患病率和病死率居高不下，在危害人类健康的同时给社会带来了巨大的经济负担。吸烟及空气污染是其主要的病因[1]。PM2.5做为环境监测指标已被大家熟悉，因其颗粒微小，可沉积于下呼吸道，故也称为可吸入肺颗粒物。虽然其在大气中所占比例较小，但由于其具有颗粒小、毒性大、传播远及空气中漂浮时间长等特点，因而对人体健康和大气环境质量的危害较大颗粒物更大[2]。研究表明：香烟烟雾对呼吸系统损害与其诱导细胞氧化应激及自噬有关[3]，但有关PM2.5诱导呼吸系统细胞氧化应激和自噬的相关研究罕有报道。本实验拟从体外途径研究PM2.5对气管上皮细胞氧化应激及自噬的影响，探讨PM2.5对人体呼吸系统负面效应的具体机制，为进一步研究防治PM2.5危害奠定一定的理论基础。

材料与方法

1 实验材料 RTE细胞购自中国科学院细胞库；磷酸酶抑制剂、PMSF 、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ROS检测试剂盒购自碧云天生物技术公司、胰酶(Trypsin-EDTA) 购自Invitrogen公司，TEMED、SDS上样缓冲液购自Amresco公司；小鼠抗β-actin、HRP标记羊抗小鼠二抗、HRP标记羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司； MTT和兔抗小鼠微管相关蛋白l轻链3(LC3)抗体购自Sigma公司；兔抗LC3B购自Cell signaling。

2 研究方法

2.1 PM2.5的采集和制备：参照文献[4]中的方法,采用PM2.5-2型中流量大气颗粒物采样器于西安交通大学医学部实验楼顶每天24 h连续采集PM2.5。

2.2 MTT法检测RTE细胞增殖：取处于对数生长期，生长状态良好的RTE细胞，用MEM培养基调整细胞密度到2×105/ml，接入96孔板，每孔100μl细胞悬液，同时设空白组， 37℃培养过夜(在细胞孔周围孔内加入100 μl无菌PBS)； 根据如下分组分别处理细胞，每组5个复孔，37℃培养24 h。PM2.5处理时间：24、48 h；PM2.5处理浓度：0 mg/L，25 mg/L，50 mg/L，100 mg/L，200 mg/L。每孔加入10μl MTT，37℃培养4h；吸出培养基，加入150μl DMSO震荡10min；酶标仪测定各孔吸光值OD。

2.3 流式检测细胞内ROS：将处于对数生长期的RTE细胞制成单细胞悬液，按每孔5×105个细胞，将细胞均匀的接种到6孔板中，37℃、5%CO2饱和湿度条件培养过夜。37℃培养3 h，PM2.5处理浓度：0 mg/L，25 mg/L，50 mg/L，100 mg/L，200 mg/L，用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞，终止消化后收集，1500r/min，5min离心，去上清，加PBS重悬；用PBS将细胞润洗2次，1500r/min，5 min，使用DCFH-DA细胞ROS检测试剂盒进行检测，最后流式细胞仪上机检测。

2.4 Western Blot法检测细胞自噬相关蛋白LC3 Ⅰ和LC3Ⅱ表达：将RTE细胞均匀接种于6孔板中，37℃、5%CO2培养24 h，并暴露PM2.5以下浓度：0 mg/L，25 mg/L，50 mg/L，100 mg/L，200 mg/L 24 h，参照文献[5 ]，将RTE细胞暴露于PM2.5100 mg/L,分别在暴露0，12，24和48 h收集PM2.5处理的细胞标本，用Western-blot法检测细胞LC3蛋白表达水平。X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影。冲洗晾干胶片，扫描胶片，用BandScan分析胶片灰度值，以LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ条带积分吸光度比值表示细胞自噬水平。

结 果

1 PM2.5对RTE细胞存活率的影响 PM2.5浓度50 mg/L，100 mg/L，200 mg/L处理RTE细胞24 h和48 h后，可见细胞存活率显著下降(P<0.05)，且呈浓度和时间依赖性，PM2.5200 mg/L处理48h细胞存活率最低(P<0.05)。PM2.525 mg/L 处理24 h，虽然细胞存活率有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)，但随着时间延长，在48 h时存活率下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

2 PM2.5诱导RTE细胞内活性氧(ROS)生成 PM2.5浓度25 mg/L，50 mg/L，100 mg/L，200 mg/L处理RTE细胞3 h后，可见胞内ROS均有所增加(P<0.05)，且呈浓度依赖性，200 mg/L时ROS生成量最大。

3 PM2.5增加细胞内自噬相关蛋白的表达 PM2.5浓度0，25 mg/L，50 mg/L，100 mg/L，200 mg/L处理RTE细胞48 h后，LC3II/LC3I条带积分吸光度比值明显升高，且具浓度依赖性(P<0.01)。PM2.5浓度100 mg/L处理RTE细胞不同时间，可见随着时间的延长，LC3II/LC3I逐渐增大，呈时间依赖性，在48h最为明显，差异有统计学意义(P<0.01)。

讨 论

自噬是细胞受到刺激后吞噬自身的细胞质或细胞器，最终在溶酶体内降解吞噬物，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新，在生物的生长调节和内环境稳态中发挥重要的功能。但自噬是一把双刃剑，同时也参与了病理过程的发生，自噬过度表达可导致细胞坏死，造成机体损伤。研究表明，自噬在慢性气道疾病的发生发展中起到重要作用，且氧化应激可促进自噬现象的发生[6-7]。

氧化和抗氧化的失衡已被证实为COPD等气道疾病的重要发病机制,氧化应激的增强可导致气道上皮的损伤、气道炎症细胞的聚集及凋亡的增加，从多途径对气道进行损害[1]。本实验使用活性氧试剂盒检测细胞内活性氧的水平，可见随着PM2.5浓度增加，ROS活性上升，并且呈现浓度依赖性。这与龙放等[5]报道的PM2.5可导致细胞氧化应激增强相符合。

当细胞开始产生自噬作用或自噬增强时，LC3I通过类泛素化酶反应与磷脂酰乙醇胺偶联形成 LC3II，而随着 LC3II 含量的增加，自噬小体数量增加,因此LC3II/LC3I可做为自噬强度的标志[8-9]。实验可见随着PM2.5暴露处理的时间延长及浓度的增加，细胞自噬的程度越强。

本实验采用MTT法观察RTE细胞的增殖，结果可见随着PM2.5浓度的增大及处理时间的延长，细胞状态变差，增值率降低，损伤严重，在PM2.5200 mg/L 最为明显。该结果进一步证实龙放[5]的观点：PM2.5可通过增加细胞内氧自由基等ROS的含量从而达到对机体损害。在低浓度、短时间PM2.5的作用下ROS活性轻度升高，可刺激细胞自噬增强，以维持内环境的稳态，细胞存活率无明显下降。但随着PM2.5浓度的升高及时间的延长，ROS活性明显增强，这样使自噬过度，会因过度“吞噬”胞内物质而造成细胞死亡，从而损伤机体。

总之，自噬和氧化应激均参与PM2.5诱导的慢性气道炎症性疾病的发生发展过程，且两者关系密切。自噬在一定程度上可以降低氧化应激造成的损伤，但随着氧化应激的增强，自噬反而会加重细胞的损害。

[1] 邓述恺，李王林，杨小琼，等．慢性阻塞性肺疾病大鼠支气管肺组织EGF-1、PDGF-β的表达及普米克令舒干预的影响[J].陕西医学杂志，2008，37(5):527-528．

[2] He K,Yang F,Zhang Q,etal.The characteristics of PM2.5 in Beijing,China[J].Atmos Environ,2001,35(29):4959-4970.

[3] Takasaka N,Araya J,Hara H,etal.Autophagy induction by SIRT6 through attenuation of insulin-like growth factor signaling is involved in the regulation of human bronchial epithelial cell senescence[J].Journal of Immunol，2014，192(3):958-968.

[4] Qu F，Ding WJ，Yi S，etal．Cytotoxicity of PM 2.5 in type II alveolar epithelial cell (MLE -12)[J]．J Toxicol，2010，24(1)：19-23．

[5] 龙 放,丁文军,邓晓蓓,等.大气细颗粒物PM2.5诱导肺上皮MLE-12细胞的氧化应激和自噬[J].中国药理学与毒理学杂志，2013,27(4):698-703.

[6] 於海洋,韩锋锋. 自噬在慢性阻塞性肺疾病中的研究进展[J].中国呼吸与危重监护杂志，2016,15(2):102-104.

[7] 何子甜，白 洁.氧化应激与自噬相互作用的分子机制[J].中国老年学志,2016,36: 1505 -1507.

[8] Cajee UF, Hull R, Ntwasa M. Modification by ubiquitin-like proteins: significance in apoptosis and autophagy pathways[J]. Int J Mol Sci，2012,13(9):11804-11831.

[9] Patel AS, Morse D, Choi AM. Regulation and functional significance of autophagy in respirato -ry cell biology and disease[J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2013,48(1):1-9.

(收稿：2016-08-10)

The effects of PM2.5 on oxidative stress and autophagy of tracheal epithelial cell

Li Dongfan，Du Xushen,Liu An.

Department of Respiratory Medicine，Xi’an Central Hospital(Xi’an 710003)

Objective：To study the effects of PM2.5on oxidative stress and autophagy of tracheal epithelial cell. Methods：After RTE cells were treated by different concentrations of PM2.5collected and prepared, cell increment rate was determined by MTT colorimetric method, whether free radical generation of intracellular reactive oxygen species (ROS) was detected with flow cytometry, whether microtubule associated protein light 1 chain 3 I protein 1 (LC31) and LC3II was expressed with Western Blot. Results： After treated by PM2.5100 mg/L and 200 mg/L, Cell survival rate were significantly decreased with concentration and time dependence, PM2.5can also increase the intracellular ROS level and LC3 II protein expression with concentration and time dependence. Conclusion： Airway epithelia cells may be damaged by PM2.5through oxidative stress and autophagy in which course oxidative stress could promote cell excessive autophagy.

Epithelial cells/physiology Oxidative stress Autophagocytosis @PM2.5

*西安市科技攻关项目[SF-1509(1)]

上皮细胞/生理学 氧化性应激 自吞噬作用 @PM2.5

R329.28

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.01.001