川芎嗪对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠心脏成纤维细胞纤维化的影响

常煜胤，路 明，卢太苓，丁 洁

川芎嗪对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠心脏成纤维细胞纤维化的影响

常煜胤，路 明，卢太苓，丁 洁

目的 探讨川芎嗪(ligustrazine)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心脏成纤维细胞纤维化的机制及影响。方法 体外培养SD大鼠乳鼠CFs，实验分为5组，A组(对照组)：培养时不加干预药物；B组(AngⅡ组)：加AngⅡ10-6mol/L；C组(川芎嗪低剂量组)：AngⅡ10-6mol/L+川芎嗪5 mg/L；D组(川芎嗪中剂量组)AngⅡ10-6mol/L+川芎嗪 10 mg/L；E组(川芎嗪高剂量组)AngⅡ10-6mol/L+川芎嗪 20 mg/L，干预48 h后，采用RT-PCR法测定α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及钙调神经磷酸酶催化亚基Aβ亚型(CnAβ)mRNA的表达情况；Western Blot法检测α-SMA及活化T细胞核因子3(NFAT3)的蛋白表达情况。结果 与A组比较，B组α-SMAmRNA、CnAβmRNA表达均显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)，α-SMA、NFAT3蛋白的表达也显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与B组比较，C组α-SMAmRNA、CnAβmRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)，α-SMA、NFAT3蛋白表达无统计学意义(P>0.05)，D组和E组α-SMA、CnAβ的mRNA表达均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，α-SMA、NFAT3蛋白表达显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 在一定浓度范围，川芎嗪以剂量依赖方式抑制AngⅡ诱导的SD大鼠CFs心肌纤维化过程，其机制可能与心脏成纤组细胞纤组化川芎嗪抑制CFs的钙调神经磷酸酶(CaN)信号通路有关。

心脏成纤维细胞纤维化；川芎嗪；血管紧张素Ⅱ；α-平滑肌肌动蛋白；钙调神经磷酸酶催化亚基Aβ亚型；钙调神经磷酸酶信号通路；活化T细胞核因子3；SD大鼠

肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活是诱发及引起心肌发生纤维化的主要发病机制，其中血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)是重要的活性成分，能诱发一系列生理病理过程，最终导致心肌纤维化[1]。川芎嗪(ligustrazine)是中药川芎的主要成分，是我国临床广泛应用的中药，具有钙离子拮抗、抗血小板聚集、改善微循环和活血化瘀等作用，临床已广泛用于急性心脑损伤、脊髓损伤等治疗[2-3]。但其在心肌纤维化过程中的作用研究相对较少。本实验观察川芎嗪对AngⅡ诱导的心脏成纤维细胞(CFs)心肌纤维化的影响，并探讨其可能的作用机制，以期对临床中西医结合改善心功能、预防及治疗心肌纤维化等方面提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料及实验动物 实验用SD大鼠乳鼠购买于徐州医学院动物中心。试剂和药物：盐酸川芎嗪(哈尔滨三联药业有限公司)；高糖DMEM培养基含双抗(南京凯基生物有限公司)；胰酶细胞消化液(碧云天生物科技研究所)；胎牛血清(杭州四季青公司)；兔抗大鼠波形蛋白单克隆抗体(武汉博奥森公司)；血管紧张素Ⅱ(美国sigma公司)；总RNA提取试剂(Trizol)(美国Invitrogen公司)；反转录试剂盒(北京天根生物科技有限公司)；Rabbit Anti-NFAT3(北京博奥森公司)，Rabbit Anti-alpha smooth muscle Actin(北京博奥森公司)。

1.2 方法

1.2.1 CFs培养与鉴定

1.2.1.1 CFs的分离、培养 取1 d～3 d鼠龄的SD大鼠乳鼠，在无菌条件下开胸剪取心脏，剪去大血管，去心包膜，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗数次，剪碎。0.125%胰蛋白酶在37 ℃水浴下反复消化(每5 min收集一次细胞悬液)，1 200 r/min离心5 min，将所得细胞置于含10%胎牛血清的细胞培养液(DMEM)培养基中，在37 ℃、5%CO2培养箱内培养90 min。采用差速贴壁法去除心肌细胞，每48 h后更换一次培养基，待细胞生长至融合状态时，以1∶2传代，采用第2代～4代细胞。

1.2.1.2 CFs的鉴定 待细胞生长至80%融合状态时，无菌条件下，弃去培养瓶中的培养基，然后用PBS反复冲洗细胞3次，最后在培养瓶中加入2 mL PBS，用显微镜观察及获取照片，免疫荧光波形蛋白染色鉴定CFs。

1.2.2 实验分组与样品培养液制备 待第4代细胞生长之亚融合状态后，换用含5%新生牛血清的DMEM无酚红培养液预适应24 h后弃掉培养基，实验分为5组，A组(正常对照组)：培养时不加干预药物；B组(Ang组)：加入AngⅡ10-6mol/L；C组(AngⅡ+川芎嗪低剂量组)：加入AngⅡ 10-6mol/L+川芎嗪5 mg/L；D组(AngⅡ+川芎嗪中剂量组)：加入AngⅡ 10-6mol/L+川芎嗪10 mg/L；E组(AngⅡ+川芎嗪高剂量组)：加入AngⅡ 10-6mol/L+川芎嗪20 mg/L。分别放入培养箱孵育48 h后观察各个指标变化情况，观察各组在实验特定时间相应指标的变化情况。

1.2.3 α-平清肌肌动蛋白(α-SMA)及钙调神经磷酸酶催化亚基Aβ亚型(CnAβ)mRNA表达的检测 RT-PCR试剂盒购买于天根生化科技有限公司。各分组细胞培育48 h后，收集细胞，用Trizol提取细胞中总RNA，使用反转录酶将RNA转录为cDNA，转录产物各2 μL，分别加入各自上下游引物，进行PCR反应，反应温度设置为94 ℃ 2 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，如此循环35次，然后72 ℃延伸10 min，4 ℃保温，以GAPDH作为内参，内参上游引物为：5’-AGG CCG GTG CTG AGT ATG TC-3’，下游引物为5’-TGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3’，产物大小为530 bp；α-SMA上游引物为5’-GGG AGT AAT GGT TGG AAT-3’，下游引物为5’-TCA AAC ATA ATC TGG GTC A-3’，产物大小为252 bp，CnAβ上游引物5’-ACG GCA GAC CCT ACA AAG-3’，下游引物为5’-CCC TCA AAG CCT CCA TCC-3’，产物大小为391 bp。将PCR产物进行琼脂糖电泳，紫外灯下拍照。

1.2.4 α-SMA及T细胞核因子(NFAT3)蛋白表达的检测 Western Blot各种试剂盒购于碧云天生物科技研究所。各分组细胞培育48 h后，收集细胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min，后将细胞碎片和裂解液移到1.5 mL离心管中，4 ℃，12 000 r/min，离心25 min，取上清，酶标仪测定蛋白浓度，根据标准曲线计算样本浓度，配平浓度后，加上样缓冲液，煮沸5 min，装入EP管中-80 ℃保存。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：经电泳分离蛋白后，将蛋白转移至NC膜上，封闭液封闭2 h，一抗孵育4 ℃过夜。复温后，洗膜每次10 min，共3次，二抗室温孵育2 h，洗膜每次10 min，共3次，用碱性磷酸酯酶显色试剂盒显色，采集图像。

2 结 果

2.1 CFs鉴定 倒置显微镜下，培养的细胞呈梭形或多角形，胞体及细胞核较大，呈椭圆形，细胞之间排列紧密，但不易聚集成团，无自发搏动，形态特征，详见图1。抗波性蛋白单克隆抗体免疫荧光染色为阳性，其中红色为波形蛋白，蓝色为DAPI标记细胞核，详见图2。

图1 分离培养的CFs光镜细胞形态(×200)

图2 CFs波形蛋白免疫荧光染色(×400)

2.2 各组α-SMAmRNA及CnAβ mRNA表达比较 以GAPDH为内参对照，结果以α-SMA/GAPDH、CnAβ/GAPDH条带灰度值比值表示。RT-PCR结果显示，与A组比较，B组α-SMAmRNA、CnAβmRNA表达均显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与B组比较，C组α-SMAmRNA、CnAβmRNA表达，差异无统计学意义(P>0.05)，D组和E组α-SMA、CnAβ的mRNA的表达均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1、图3。

表1 各组α-SMAmRNA及CnAβ mRNA表达比较

图3 α-SMA及CnAβ mRNA的表达

2.3 各组α-SMA及NFAT3蛋白表达比较 以GAPDH为内参对照，结果以α-SMA/GAPDH、NFAT3/GAPDH条带灰度值的比值表示。Western Blot结果显示，A组比较，B组α-SMA、NFAT3蛋白表达显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与B组比较，C组α-SMA、NFAT3蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，D组和E组α-SMA、NFAT3蛋白表达均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2、图4。

表2 各组α-SMA 及NFAT3蛋白表达量比较

图4 各组α-SMA 及NFAT3蛋白表达量的变化

3 讨 论

心肌纤维化是心功能衰竭、心律失常的重要病理基础。CFs是心肌纤维化的主要效应细胞，其可支持心肌细胞作用，还有自分泌及旁分泌功能，能分泌多种生物活性物质影响心脏的结构及功能[5-6]。在细胞水平上，已经证明CFs向心脏肌成纤维细胞表型转化是启动心肌纤维化的核心[7]，其标志是α-SMA表达明显增加，同时通过自分泌、旁分泌活性因子促进基质合成，促进心肌纤维化进程[8-10]。因此α-SMA可作为心肌纤维化进程中可靠的标志性抗原。典型的CFs形态呈梭形或多角形，胞体及细胞核较大，呈椭圆形，胞质透明，细胞之间排列紧密，但不易聚集成团，无自发搏动，本实验通过酶消化差速贴壁法获得CFs形态典型，通过免疫荧光染色鉴定，纯度较高，均质性好，适合用于实验。

已知多种细胞因子能诱导成纤维细胞的纤维化，表达其特异性的标记物α-SMA，从而促进心肌纤维化，如转化生长因子β(TGF-β)、白细胞介素(IL)-4、IL-13等。在众多致心肌纤维化的因素中，RAAS过度激活在心肌纤维化中发挥的重要作用已得到公认，AngⅡ是其主要的效应分子[11]。钙调神经磷酸酶(CaN)是体内唯一的 Ca2+/钙调素依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，介导Ca2+依赖的细胞增殖、肥大、凋亡、分泌等多种功能的信号通路。近年来发现钙调神经磷酸酶信号通路是调控心室肥大的重要通路[12-13]。NFAT是CaN重要的下游靶点，活化的NFAT3在心肌纤维化中起着重要的作用，同时其还可与其他因子结合参与调节心房利钠因子(AVF)和心肌肌球蛋白重链(MHC)等基因的表达，从而影响心肌功能[14]。本实验应用AngⅡ在体外作用于心脏CFs，避免其他生物活性物质和血流动力学的影响，在干预CFs 48 h后，发现α-SMA表达明显增加，提示AngⅡ可直接作用于CFs，促进其纤维化的发生发展，进一步证实AngⅡ参与心肌纤维化发病过程，与以前文献研究相一致。本实验还发现，用AngⅡ干预CFs 48 h后，在α-SMA表达明显升高的同时，CnAβ mRNA及下游活化信号分子NFAT3蛋白的表达均明显增加，提示AngⅡ促CFs表型转化作用可能与CaN信号通路有关。

川芎嗪是活血化瘀中药川芎的主要成分，具有抑制炎症细胞激活、减少促炎症反应细胞因子产物、抗氧化、抗凋亡等作用，临床已广泛用于急性心脑损伤、脊髓损伤等治疗[15-17]。在心血管疾病治疗中，川芎嗪被证实具有抗缺血-再灌注损伤及抗氧化等保护作用[18-19]。川芎嗪对心肌成纤维细胞表型转化作用的研究相对较少，本实验应用不同浓度川芎嗪+特定浓度AngⅡ刺激CFs，与单纯用相同浓度AngⅡ刺激组比较发现，在特定浓度范围内川芎嗪可按剂量依赖方式抑制AngⅡ诱导的CFs α-SMA的表达，提示其可直接作用于CFs，具有抑制CFs的心肌纤维化作用。本实验还观察到加用川芎嗪后，在抑制CFs纤维化进程的同时，对UⅡ诱导的CFs CnAβ mRNA及下游活化信号分子NFAT3蛋白的表达也受到抑制，这提示川芎嗪抑制CFs纤维化进程的机制可能与其阻滞CaN信号通路有关。这为川芎嗪在临床预防治疗心肌纤维化的进展，改善心功能等方面提供有力的实验证据。

[1] Jia L，Li Y，Xiao C，etal.Angiotensin Ⅱ induces inflammation leading to cardiac remodeling[J].Frontiers in Bioscience，2012，17(1)：221-231.

[2] Ni X，Wong SL，Wong CM，etal.Tetramethylpyrazine protects against hydrogen peroxide-provoked endothelial dysfunction in isolated rat aortic rings： implications for antioxidant therapy of vascular diseases[J].Evidence-based Complementary and Alternative Medicine：eCAM，2013，2014(2)：627181.

[3] 钱超.川芎嗪对心血管的药理作用[J].内蒙古中医药，2014，33(23)：107-108.

[4] 徐广侠.川芎嗪的药理作用及临床应用观察[J].中国卫生产业，2014，(35)：187-188.

[5] Camelliti P，Borg TK，Kohl P.Structural and functional characterisation of cardiac fibroblasts[J].Cardiovascular Research，2005，65(1)：40-51.

[6] Zhang Y，Li Y，Wei R，etal.Urotensin Ⅱ is an autocrine/paracrine growth factor for aortic adventitia of rat[J].Regulatory Peptides，2008，151(1-3)：88-94.

[7] 蔡辉，张蓓蓓.心脏成纤维细胞在心肌纤维化中的作用[J].微循环学杂志，2014(4)：80-82.

[8] Bayes-Genis A，Antonio MD，Vila J，etal.Head-to-Head comparison of 2 myocardial fibrosis biomarkers for long-term heart failure risk stratification：ST2 versus galectin-3[J].Journal of the American College of Cardiology，2014，63(2)：158-166.

[9] Eyden B.The myofibroblast： phenotypic characterization as a prerequisite to understanding its functions in translational medicine[J].Journal of Cellular and Molecular Medicine，2008，12(1)：22-37.

[10] Rohr S.Cardiac fibroblasts in cell culture systems： myofibroblasts all along?[J].Journal of Cardiovascular Pharmacology，2011，57(4)：389-399.

[11] 马越，余洋，贾岩岩，等.钙蛋白酶对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖及纤维化模型的影响[J].中山大学学报(医学科学版)，2013，34(4)：491-497.

[12] Xiao P，Ning L.Calcineurin-NFAT signaling is involved in phenylephrine-induced vascular smooth muscle cell proliferation[J].Acta Pharmacologica Sinica，2009，30(5)：537-544.

[13] Qin N，Wei LW，Huang XN.Total ginsenosides fought against right ventricular hypertrophy through inhibiting calcineurin signal pathway[J].Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine，2015，35(1)：93-97

[14] Berry JM，Le V，Rotter D，etal.Reversibility of adverse，calcineurin-dependent cardiac remodeling[J].Circulation Research，2011，109(4)：407-417.

[15] 蒋跃绒，陈可冀.川芎嗪的心脑血管药理作用及临床应用研究进展[J].中国中西医结合杂志，2013，33(5)：707-711.

[16] 修春英，蔡辉，赵智明，等.川芎嗪对心脏成纤维细胞增殖及胶原合成的影响[J].福建中医药大学学报，2008，18(2)：25-27.

[17] Yu Y，Wang SR，Sun YK.Effects of ligustrazine on the mitochondrial structure and functions in the process myocardial hypertrophy[J].Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine，2012，32(5)：661-665.

[18] 郭自强，王硕仁，朱陵群，等.活血药对血管紧张素Ⅱ致心肌肥大细胞内钙浓度变化的影响[J].环球中医药，2009，2(2)：99-101.

[19] Guo L，Wang A，Sun Y，etal.Evaluation of antioxidant and immunity function of tetramethylpyrazine phosphate tablets in vivo[J].Molecules，2012，17(5)：5412-5421.

(本文编辑薛妮)

The Influence of Ligustrazine on Cardiac Fibroblasts Fibrosis Induced by Angiotensin Ⅱin Rats

Chang Yuyin,Lu Ming,Lu Tailing,Ding Jie

The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,Xuzhou 221000,Jiangsu,China

Objective To observe the effect of ligustrazine on angiotensinⅡ(AngⅡ)-induced cardiac fibroblasts(CFs) fibrosis and its mechanisms.Methods The CFs of neonatal Sprague-Dawley (SD) rats were isolated with the method of trypsin digestion and differential anchoring velocity,then cultured in vitro.The generation 2-4 of CFs were used for the experiment and randomly divided into 5 groups which were control group cultured without AngⅡ or ligustrazine(group A) ,AngⅡ group cultured with AngⅡ 10-6mol/L(group B),and ligustrazine groups(group C,group D,group E) cultured with AngⅡ 10-6mol/L and ligustrazine 5,10,20 mg/L,respectively.CFs were cultured for 48 h and the smooth muscle alpha-actin (α-SMA),beta isoform of calcineurin (CnAβ) mRNA expression were examined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR),the α-SMA,nuclear factor of activated T-lymphocyte-3 (NFAT3) protein expression by western blot analyses.Results Compared with group A,the expressions of α-SMA,CnAβ mRNA and α-SMA,NFAT3 protein were upregulated in group B(allP<0.05).Compared with group B,the expressions of α-SMA,CnAβ mRNA and α-SMA,NFAT3 protein in group D and group E were obviously decreased(allP<0.05).Conclusion Within a given concentration range,ligustrazine can inhibit the expression of α-SMA in a dose-dependent manner to delay the differentiation of CFs induced by AngⅡ.Ligustrazine can inhibit the expression of CaN and downstream signaling molecules NFAT3,which indicates that the inhibition of CFs fibrosis process may be related to the CaN signaling pathway.

ligustrazine； angiotensinⅡ；smooth muscle alpha-actin；beta isoform of calcineurin；CaN signaling pathway；nuclear factor of activated T-lymphocyte-3；cardiac fibroblasts； Sprague-Dawley rats

徐州医学院(江苏徐州 221000)，E-mail：787013497@qq.com

引用信息：常煜胤，路明，卢太苓，等.川芎嗪对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠心脏成纤维细胞纤维化的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14(23)：2758-2761.

R322.1 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.23.012

1672-1349(2016)23-2758-04

2016-04-28)