辛伐他汀对大鼠颅脑外伤后弥漫性轴索损伤的实验研究

史立信，胡福广，徐兆冰，吴景春，张文超，王传海

辛伐他汀对大鼠颅脑外伤后弥漫性轴索损伤的实验研究

史立信1，胡福广2，徐兆冰3，吴景春1，张文超1，王传海1

目的 观察辛伐他汀对大鼠颅脑外伤后弥漫性轴索损伤的治疗效果。方法 用加速-减速装置制作大鼠弥漫性轴索损伤(DAI)模型，分为安慰剂组与辛伐他汀组，口服生理盐水与辛伐他汀14 d，另选健康SD大鼠作为对照组。以经修改神经功能损伤程度评分(mNSS)来测定神经功能恢复状态；以淀粉样-β阳性前体蛋白(APP)单克隆抗体进行免疫组化实验以测定轴索损伤程度，以Bielshowshy银染法测定神经轴索密度。结果 与安慰剂组及对照组比较，辛伐他汀组mNSS评分明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；辛伐他汀组APP阳性神经轴索密度明显降低，而银染阳性神经轴索密度明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；mNSS评分与神经轴索密度呈明显负相关。结论 辛伐他汀能促进颅脑外伤后弥漫性周索损伤中神经轴索损伤的修复与增长。

弥漫性轴索损伤；颅脑外伤；辛伐他汀；免疫组化；淀粉样-β阳性前体蛋白

弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury，DAI)是颅脑外伤的常见伴发疾病也是颅脑外伤后重要的致残原因[1]，神经轴索损伤和恢复及颅脑外伤后功能康复具有重要的作用，目前关于DAI这一病理过程的基础和临床研究[2]。辛伐他汀被多项研究证实在颅脑外伤中具有多重作用[3-4]，本研究通过动物实验分析该药在颅脑外伤后弥漫性轴索损伤中的药物作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 DAI模型建立 选取健康成年SD大鼠40只，雌雄各半，体重250 g～360 g，用4%水合氯醛麻醉(0.2 mL/100 g～0.4 mL/100 g)后，以西安交通大学医学院刘晓斌医师瞬间加-减速损伤装置制作DAI模型[5]：将已麻醉大鼠固定于旋转装置上，麻醉苏醒后在其尚处于激烈挣扎间歇期按动实验装置扳机，使其头颅瞬间旋转90°，并记录大鼠生命体征及行为改变，把DAI模型大鼠随机分为实验组和安慰剂组(生理盐水组)，各20只，另选20只SD大鼠作为健康对照组并正常饲养。安慰剂组SD大鼠给予生理盐水口服持续14 d；实验组SD大鼠给予辛伐他汀1 mg/(kg·d)，连续14 d。3组大鼠于实验第15 d分别以4%水合氯醛麻醉，依次经心脏灌注生理盐水及4%多聚甲醛至四肢抽搐、肺及肝脏变白，而后迅速解剖分离全脑，以4%多聚甲醛固定48 h，然后以冠状位等厚度分为7块取材，再脱水、透明、浸蜡及包埋处理。

1.2 免疫组织化学及银染色检查 本实验以淀粉样-β阳性前体蛋白(amyloid β precursor protein，APP)单克隆抗体标记发生损伤的神经轴索[6]，并用Bielshowshy银染色以显示神经轴索。对于处理过的脑组织以生物组织切片机以5 μm厚度连续切片，脱蜡，水化，然后3%H2O2处理以阻断内源性过氧化物酶活性，将切片置于盛有1%柠檬酸溶液的高压锅中煮沸10 min以修复抗原，之后向组织切片上滴加1∶500的抗-APP一抗4 ℃孵育过夜，再滴加偶联有生物素的二抗室温下反应2 h，最后以DAB在光镜下显色。为了显示神经轴索形态，对脑组织切片进行Bielshowshy银染色：先把组织切片置于20%硝酸银中孵育，之后在氨水中返蓝。

2 结 果

2.1 辛伐他汀对DAI后大鼠神经病学行为的影响 采用mNSS损伤评分来测定SD大鼠加速-减速致DAI后的神经病学行为改变，在DAI后第1天mNSS评分11分，从伤后第3天神经功能即开始恢复至第14天；与安慰剂组比较，治疗组辛伐他汀能明显降低mNSS评分(第7天：辛伐他汀组6.3分±0.5分vs安慰组8.4分±0.6分；P=0.012；第14天：辛代他汀组4.8分±0.4分vs 安慰剂组7.6分±0.6分，P=0.007)。详见图1。

图1 3组大鼠神经功能损伤mNSS评分变化

2.2 辛伐他汀对轴索损伤的影响 比较辛伐他汀对轴索损伤药物作用，对DAI安慰剂组和辛伐他汀组大鼠脑组组进行淀粉样-β阳性前体蛋白(amyloid β precursor protein，APP)免疫组化及Bielshowshy银染色。结果：辛伐他汀明显降低APP阳性损伤轴索密度，差异有统计学意义(P=0.014)；并发现辛伐他汀明显升高Bielshowshy银染阳性轴索密度，且差异有统计学意义(P=0.021)。详见图2。

注：A、D为对照组；B、E为安慰剂组组；C、F为辛伐他汀组。(图A-C为IHC染色，×400倍；图D-F为Bieschowshy银染色，×400倍)

图2 3组大鼠APPIHC染色与Bieschowshy银染示轴索密度变化

2.3 DAI后大鼠轴索数量与神经病学行为关系 对DAI第14天mNSS评分与银染所示轴索密度进行Pearson相关性分析，结果：mNSS评分与轴索密度明显负相关，相关系数r=-0.96，P=0.006。详见图3。

图3 轴索数量与mNSS评分相关性分析

3 讨 论

DAI约占重型颅脑损伤28%～42%，死亡病人中占29%～43%，病情危重，病死率和致残率高，是导致颅脑损伤病人神经功能障碍、植物状态和死亡的主要原因[7-9]。既往对DAI治疗缺乏特异性手段，随着对其病理生理学机制研究不断深入，一些针对DAI病变进程的药物不断地得到动物实验验证，并有些已应用于临床中[10-15]，但是关于降脂药辛伐他汀在DAI治疗作用的基础研究还未见报道，所以本研究通过动物实验探讨辛伐他汀对DAI的药物作用。

他汀类药物是3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)还原酶抑制剂，具有抗炎、抗氧化作用、免疫抑制、改善内皮功能，减轻炎症反应和再灌注损伤，有助于保持病理情况下血脑屏障的完整性和星型胶质细胞的功能，减少神经元的继发性损害。辛伐他汀可明显抑制颅脑损伤后Caspase-3的表达，阻碍其活化，阻滞由其介导的蛋白酶级联反应导致的细胞凋亡过程，发挥神经保护作用[16-17]。

通过瞬间加-减速损伤装置制作大鼠脑外伤后弥漫性轴索损伤模型，该模型具有颅脑外伤后DAI多项特征，故可用于DAI实验研究[18]。实验性颅脑外伤后1 h内大鼠即出现轴索损伤，在随后数小时内轴索损伤范围不断扩大，在损伤后80 h便出现大量轴索肿胀[19]。轴索损伤不断加重可产生一系列病理生理学改变：钙离子内流、神经纤维骨架解体、神经轴索细胞膜破裂及最后轴索不可逆的断裂，因此理论上可通过阻止该过程的某些环节而起到治疗DAI作用[20]。本实验选用APP单克隆抗体以免疫组化方法和Bielshowshy银染显示受损的神经轴索，实验结果显示神经轴索损伤的形态改变有：轴索增粗、串珠状及球状改变。

有研究报道：当与其他相关药物合用时辛伐他汀可减轻脑血栓后神经轴索的损伤[21]，本实验验证辛伐他汀单药对神经轴索的作用，辛伐他汀是脂溶性药物，比其他水溶性他汀类药物更易通过血脑屏障。本实验结果显示辛伐他汀明显减少APP阳性损伤轴索密度，提示该药能减轻颅脑外伤后弥漫性轴索损伤。辛伐他汀治疗后第14天，与对照组和安慰剂组比较，Bielshowshy银阳性神经轴索密度明显增高，该结果与神经行为缺损mNSS评分相一致。但需要大样本实验以进一步验证这种相关性。

本实验辛伐他汀治疗后轴索数量的增加或许是轴索损伤的减轻和(或)颅脑外伤后轴索再生增强的结果。由于实验条件所限，没有进行进一步实验以明确其中机制，但Di Giovanni[22]对体外培养的PCN细胞株施以辛伐他汀后发现受损的神经轴索很快修复增长，并且这种作用能被LY29402抑制而能被LiCL增强，认为辛伐他汀的促轴索生长作用是通过PI-3k路径实现。有实验研究表明，单纯地移除抑制性因子不足以使神经轴索成功再生[23]，而另有实验证据提示活化内源性途径或许能实现神经轴索的增生[24]，Park等[25]发现mTOR就是其中一种调节内源性调节蛋白，这种蛋白质在神经元发育过程中非常活跃，而在成熟神经元中活性较低；若将损伤的视神经元mTOR路径负性调节因子PTEN基因删除，则会观察到轴索迅速增长，由于mTOR是PI-3K/Ak路径下游靶向分子，结合本实验结果，推测辛伐他汀之所以能增加轴索密度，有可能是通过激活PI-3K/Ak路径实现。

综上所述，本实验显示辛伐他汀单药能够明显减少神经轴索损伤并改善实验性大鼠颅脑外伤后DAI的神经功能。

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(本文编辑薛妮)

Efficacy of Simvastatin on Diffuse Axonal Injury after Cranial Injury in Rats

Shi Lixin,Hu Fuguang,Xu Zhaobing,Wu Jingchun,Zhang Wenchao,Wang Chuanhai

People’s Hospital of Qinghe,Qinghe 054800,Hebei,China

Shi Lixin

Objective To observe the effect of simvastatin on the treatment of diffuse axonal injury (DAI) after traumatic brain injury (TBI) in rats.Methods Adult healthy Sprague-Dawley (SD) rats DAI models after brain injury was made by accelerating and decelerating apparatus ,which were then divided by two groups.Saline and simvastatin was administrated for 14 days.A modified neurological severity scores (mNSS) test was performed to evaluate degree of neural functional recovery.Immunohistochemistry studies with amyloid β-precursor protein (APP) was performed to mark the axonal injury ,and Bielshowshy`s silver dying was processed to evaluate the axon density.Results Symvastatin decreased the mNSS score in the simvastatin group.The density of APP positive neural axons decreased obviously in the simvastatin goup ,with which of silver postive axons elevated in it.The mNSS score was negatively correlated with the density of neural axons through Pearson correlation analysis.Conclusion Simvastatin can repair axonal injury and promote axonal regeneration in DAI after TBI.

diffuse axonal injury； traumatic brain injury；simvastatin； immunohistochemistry；amyloid β precursor protein

1.河北省清河县人民医院(河北清河 054800)；2.河北医科大学第二医院；3.山东省聊城市第二人民医院

史立信，E-mail：wbslx8099@163.com

R651.1 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.23.014

1672-1349(2016)23-2766-04

2016-03-28)

引用信息：史立信，胡福广，徐兆冰，等.辛伐他汀对大鼠颅脑外伤后弥漫性轴索损伤的实验研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14(23)：2766-2768.