抗菌肽对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌机制研究进展Δ

郭文杰，罗 鹏，荆许恩，张鑫婷，许婷婷，陈楚娜，陈 新#（.南方医科大学珠江医院呼吸内科，广州 50220；2.南方医科大学第二临床医学院，广州 5055）

抗菌肽对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌机制研究进展Δ

郭文杰1，2＊，罗 鹏1，2，荆许恩1，张鑫婷1，2，许婷婷1，2，陈楚娜1，2，陈 新1，2#（1.南方医科大学珠江医院呼吸内科，广州 510220；2.南方医科大学第二临床医学院，广州 510515）

目的：了解抗菌肽对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抗菌机制，以期为抗菌肽临床治疗MRSA肺炎提供参考。方法：查阅近年来国内外相关文献，就各种抗菌肽对MRSA的抗菌机制的相关研究进行归纳和总结。结果与结论：抗菌肽相对于抗菌药物拥有较多优势——（1）抗菌肽是生物天然免疫系统的组成部分，容易获得；抗菌肽氨基酸数较少、肽链较短，减小了合成抗菌肽的难度，为大量人工合成抗菌肽提供了可能性。（2）抗菌肽表面富含正电荷，YD1、Melittin和Bac8c均通过其表面的正电荷与MRSA表面的负电荷结合并黏附于细菌表面，进一步破坏细胞膜从而杀灭细菌；LL-37能抑制MRSA生物膜的形成并破坏已经形成的MRSA生物膜；hBD3-CBD通过在MRSA周围聚集进而发挥杀菌作用；J-AA、J-RR和J-AR利用其结构特殊性，通过内/外膜透化机制，破坏MRSA细胞膜，从而杀伤细菌。上述机制皆不涉及受体与配体之间的结合，避免了MRSA对抗菌肽产生耐药性。（3）大部分抗菌肽在极低的MIC下即已对MRSA展示出了强大的杀菌作用。抗菌肽的使用也存在一定的局限性——（1）抗菌肽的肽链较短，增加了提取难度，人工合成抗菌肽则提高了药物成本。（2）抗菌肽的短肽链和简单结构，使其稳定性较差。（3）抗菌肽是一种异种蛋白，可能诱发患者产生一系列的免疫反应和毒性作用。

抗菌肽；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；肺炎

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.23.37

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是临床常见的一种多重耐药菌，主要造成院内感染和社区感染。MRSA能定植于人体内的不同组织表面导致多种疾病，38.3%的感染患者可从痰液分离培养得到MRSA，MRSA肺炎是院内危重患者的常见感染类型，其中肿瘤患者的MRSA肺炎感染率达11.4%[1-2]。由于MRSA的多重耐药性，使得MRSA肺炎的临床治疗困难，患者迁延不愈且病死率较高。抗菌肽是一类由生物免疫系统诱导产生的活性多肽，是天然免疫系统的重要组成部分，已有研究将抗菌肽外用于感染部位并取得了较好的效果[3]。鉴于此，笔者查阅近年来国内外相关文献，就各种抗菌肽对MRSA抗菌机制的相关研究进行归纳和总结，以期为抗菌肽临床治疗MRSA肺炎提供参考。

1 MRSA的耐药机制

MRSA的耐药性主要依赖于一层胞外多糖基质构成的生物膜，由于生物膜的阻隔作用使膜内部分细菌免受抗菌药物的杀伤作用，并可在适当时候释放至膜外造成患者感染复发和迁延不愈。临床使用的大部分抗菌药物只能杀灭活动中的MRSA，生物膜中细菌的代谢较弱，多数处于休眠状态。生物膜的保护作用使MRSA能有充足的时间开启耐药基因，产生大量抗菌药物水解酶，进一步降解进入生物膜内的抗菌药物，使MRSA获得耐药性[4-5]。MRSA的耐药机制还涉及对抗菌物质相应受体的封闭作用，通过改变自身细胞膜受体，阻碍抗菌物质通过受体结合黏附于细胞膜，从而逃避杀伤。

2 抗菌肽

抗菌肽具有来源广泛、抗菌谱广、抗菌活性强和不产生耐药性等优点[6]。抗菌肽的抗菌机制主要在于其能抑制细菌生物膜的形成，并破坏已形成的生物膜，通过激发机体的天然免疫功能杀死游离细菌，从而发挥有效的杀菌作用，其杀菌机制不涉及受体机制的特点，避免了MRSA对其产生耐药性[7]。

2.1 YD1（Glycin-rich antimicrobial peptide）

YD1是一种从解淀粉芽孢杆菌中分离出来的多肽类抗菌物质，多存在于发酵食物中（如泡菜）。抗菌肽YD1表面黏附着大量正电荷，而细菌细胞膜表面存在负电荷团，故细菌能被YD1黏附、杀伤。YD1的正电荷与MRSA的负电荷结合，在细菌表面形成包裹，黏附于细菌表面的YD1通过穿胞作用进入细菌细胞膜内，进一步激活细菌DNA，诱导细菌凋亡。YD1的穿胞作用不涉及受体结合，避开了MRSA产生耐药性的途径。

Rahman MS等[8]的研究旨在比较抗菌肽YD1、杆菌肽和万古霉素对MRSA的杀菌作用，检测了3种抗菌物质的最低抑菌浓度（MIC），进一步评价其对MRSA肺炎的治疗作用。结果显示，杆菌肽对MRSA的MIC为64 µg/mL，万古霉素的MIC＞128µg/mL，抗菌肽YD1的MIC为32µg/mL，可见抗菌肽YD1较杆菌肽和万古霉素显示出明显的优势（P＜0.05）。抗菌肽YD1对MRSA具有明显的抑制作用，其杀菌机制主要为诱导细菌灭亡，且不会使细菌产生耐药性，在治疗MRSA肺炎的药物研究中具有较好的前景。

2.2 LL-37（Leucine Leucine-37）

抗菌肽家族主要包括防御素和Cathelicidin，LL-37是Cathelicidin家族唯一的抗菌物质。LL-37存在于人体内多种上皮细胞、免疫细胞、体液和创伤分泌物中，能够发挥抗微生物活性、参与机体免疫调节和促进创伤修复等作用，是具有多种功能的活性小分子肽[9]。

LL-37针对MRSA肺炎的杀菌机制包括直接杀死游离MRSA，抑制MRSA生物膜的形成和破坏已经形成的MRSA生物膜。MRSA在肺组织表面的初始附着量决定了其能否在肺内形成成熟的细胞膜，而LL-37能够直接减少人体肺组织表面的MRSA初始附着量，并影响生物膜的形成[10]。此外，LL-37还能够抑制MRSA在肺组织表面的局部聚集，通过阻碍MRSA在肺组织表面的附着和聚集成团，从而有效阻碍MRSA形成有效稳定的生物膜。LL-37参与构成人体免疫系统，能募集各种免疫细胞（如中性粒细胞），调节人体炎症反应，协调非特异性和特异性两大免疫系统，从而发挥免疫调节作用杀灭MRSA。由于这一杀菌机制主要通过调节和诱导人体免疫系统产生，因而能避免MRSA对抗菌肽LL-37产生耐药性[11]。

Dürr UH等[12]的研究通过结晶紫染色法分析了抗菌肽LL-37对MRSA初始附着量的影响。该研究在无菌96孔板中接种MRSA菌液100µL，实验组在每孔各加入不同浓度的LL-37溶液100µL，两组皆在37℃下培养24 h，并通过酶标仪在结晶紫染色后测定其570 nm吸收度值。结果显示，在LL-37溶液浓度为0.625µmol/L时，LL-37对MRSA临床株生物膜形成的抑制率为27%，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；LL-37溶液浓度增加至3.130µmol/L时，LL-37对MRSA临床株生物膜形成的抑制率达63%。对两组培养基形成的生物膜在激光共聚焦显微镜下扫描的结果显示，两组培养基形成的生物膜差异显著：对照组培养基形成的生物膜荧光信号强、结构完整、细菌排列致密，成型生物膜平均厚度为15～25µm，生物膜发育较为成熟；实验组培养基形成的生物膜荧光信号弱、细菌排列疏松，成熟菌斑总量明显减少，成型生物膜厚度偏薄（3～7µm）；两组成型生物膜厚度差异有统计学意义（P＞0.05）。

抗菌肽LL-37可抑制和破坏MRSA生物膜，还参与构成人体非特异性免疫系统，减少超敏反应的发生率。这些优势使抗菌肽LL-37在治疗MRSA肺炎上具有巨大的潜力。

2.3 hBD3-CBD（Human beta defensin 3-Carbohydrate Binding Domain）

hBD3为抗菌肽防御素家族的重要成员，参与构成人体非特异性免疫系统，并在生理条件下具有一般抗菌肽不具有的稳定性。hBD3广泛表达于人体的免疫细胞、上皮细胞和创伤部位[4]。

hBD3的抗菌机制主要与其糖类结合域（CBD）相关，通过与MRSA表面糖链的结合在MRSA附近聚集，并黏附于MRSA表面，再通过hBD3表面的正电荷与MRSA表面负电荷结合并经过一系列反应，诱导MRSA细胞膜破裂，从而杀灭细菌[13]。

为进一步提升hBD3的抗菌效力，CBD的寡核苷酸链和hBD3基因片段被研究者重组，从而增强抗菌肽hBD3黏附细菌的能力，得到合成产物hBD3-CBD。通过重组质粒将CBD和hBD3基因融合，并在真核细胞（pVAX1）中表达，通过细胞保护实验对其抑菌能力进行评估[13]。该研究分别给3组培养基接种MRSA，其中2组分别加入hBD3和hBD3-CBD，另一组作为对照组，通过计算3组培养基在感染3、6、12 h不同时间点的菌落生成数和上清液中炎症因子指标白细胞介素6（IL-6）的浓度来评价抗菌肽的抑菌能力和抗炎症能力。对各组上清液进行IL-6浓度检测的结果显示，感染6、12 h时，对照组的转染细胞的培养上清液中IL-6的浓度较感染前明显增加，且显著高于另外2组。同时，菌落计数结果显示，在感染6、12 h时，hBD3组和hBD3-CBD组的抑菌作用明显高于对照组；感染12 h时，hBD3组和hBD3-CBD组的菌落生成数差异有统计学意义（P＜0.05），hBD3-CBD显示出对MRSA更强的抗菌作用。可见，通过增加CBD的数量提高抗菌肽对细菌的黏附作用，能使人工合成的新型抗菌肽hBD3-CBD较hBD3具有更强的抑菌作用。

2.4 J-AA（Junction-Anoplin-Anoplin）、J-RR（Junction-Arginine-and Trytophan-Rich Hexapeptide-Arginine-and Trytophan-Rich Hexapeptide）和J-AR（Anoplin-Arginine-and Trytophan-Rich Hexapeptide）

Anoplin是一种从黄蜂毒液中提取的抗菌肽，RW（Arginine-and Trytophan-Rich Hexapeptide）是通过“链接”化学合成的人工抗菌肽，从而合成新型抗菌肽J-AA、J-RR和J-AR。这3种抗菌肽均拥有双亲性结构，能够穿透细菌的细胞膜并在短时间内破坏细菌细胞膜的完整性，包括外膜透化作用和内膜透化作用。这两种穿透细胞膜的机制不需要受体介导，使得MRSA无法对抗菌肽进行受体的改变从而产生耐药性。

研究者将这3种抗菌肽与临床常规使用的抗菌药物卡那霉素及其亲本Anoplin和RW进行比较，实验动物使用MRSA肺炎模型大鼠[14]。结果显示，卡那霉素对MRSA的MIC＞298µg/mL，Anoplin和RW的MIC分别为73.8、64.3µg/mL，而人工合成抗菌肽J-AA、J-RR和JAR的MIC分别为21.1、18.7、19.9µg/mL。可见，该研究中的新型抗菌肽的抗MRSA作用是其亲本的4～6倍，同时强于抗菌药物卡那霉素的抑菌能力。该研究结果还显示，J-RR对MRSA的抑制效果较好，J-AR和J-RR的剂量达到120 mg/kg后才显示出对MRSA肺炎模型大鼠的毒性作用，具有较大的安全治疗窗。J-RR通过内外膜透化机制破坏MRSA细胞膜的完整性，不依赖受体的结合从而具有不产生耐药性的优点，故而这种新型合成抗菌肽成为治疗MRSA肺炎的重要选择之一。

2.5 Melittin和Bac8c（Bactenecin-8c）

Melittin是从蜂毒中提取的多肽类抗菌物质；Bac8c是利用合成技术生成的人工抗菌肽。细菌细胞膜的负电荷被两者表面的正电荷团结合，相互黏附最终形成致死的孔隙，进而导致细菌被杀灭。

研究者比较了Melittin和Bac8c对MRSA菌株的作用，该研究分别在不同培养基中加入同样浓度的不同菌株的MRSA，并且分别注入抗菌肽Melittin和Bac8c[15]。结果显示，Melittin在不同菌株的MRSA中MIC均为5 µg/mL；而Bac8c在WBG8287菌株中MIC为7µg/mL，在W17S和Aus3菌株中MIC均达80µg/mL。结果还显示，Melittin对不同菌株的MRSA具有更稳定的治疗作用，杀灭MRSA的能力更强。

2.6 其他

TempL（Temporin L）是从青蛙体内提取的抗菌肽，由13个氨基酸组成，其对MRSA的MIC为25.5µg/mL[6]。但由于TempL的肽链太短，造成提取工艺复杂和操作困难。TempL的抗菌机制尚不清楚，研究者们正致力于寻找该肽链中决定TempL多种抗菌能力的片段，为人工合成TempL提供可能性[16]。

抗菌肽Clavanin-A对MRSA的MIC为2.4µg/mL，具有强大的杀菌作用，但由于表达量少且合成困难限制了其临床研究的开展[6]。研究者通过对Clavanin-A进行修改，得到新型抗菌肽Clavanin-MO，其杀菌作用与亲本Clavanin-A相仿，且Clavanin-MO基因能在毕赤酵母中得到大量的稳定表达，可能成为未来治疗MRSA肺炎的重要抗菌药物[17]。

活鱼体内有一种Piscidin家族的抗菌肽。Rbmoro（Moronecidin）隶属于Piscidin家族，由70个氨基酸组成，可从岩鲤科鱼中提取，对MRSA的MIC为6.9µg/mL[5]。研究者已获得决定Rbmoro杀菌能力的相应肽段，并通过人工合成在不同的细菌中将此肽段大量表达。但当这种具有杀菌作用的肽段回输至活鱼体内后，却产生了明显的溶血反应，溶血的原因为此肽段对活鱼的红细胞产生了破坏作用，而相应的机制尚未明确[17]。

抗菌肽杀菌机制包括阻碍MRSA生物膜形成，影响基因表达而诱导细菌灭亡，促进上皮组织生长覆盖创口，调节树突状细胞表达和招募TB淋巴细胞等[3，18-19]。目前发现对MRSA具有杀菌作用的抗菌肽较多，其中一部分对MRSA的杀菌效果显著，但由于其对患者同时存在的毒性作用、稳定性差和提取难度大等原因，使得其离临床应用依然有一定距离。

3 结语

综上所述，抗菌肽相对于抗菌药物拥有较多优势：（1）抗菌肽是生物天然免疫系统的组成部分，容易获得；抗菌肽氨基酸数较少、肽链较短，减小了合成抗菌肽的难度，为大量人工合成抗菌肽提供了可能性。（2）抗菌肽表面富含正电荷，YD1、Melittin和Bac8c均通过其表面的正电荷与MRSA表面的负电荷结合并黏附于细菌表面，进一步破坏细胞膜从而杀灭细菌；LL-37能抑制MRSA生物膜的形成并破坏已经形成的MRSA生物膜；hBD3-CBD通过在MRSA周围聚集进而发挥杀菌作用；J-AA、J-RR和J-AR利用其结构特殊性，通过内/外膜透化机制破坏MRSA细胞膜，从而杀伤细菌。上述机制皆不涉及受体与配体之间的结合，避免了MRSA对抗菌肽产生耐药性。（3）大部分抗菌肽在极低的MIC下即已对MRSA展示出了强大的杀菌作用。

然而，抗菌肽的使用也存在一定的局限性：（1）抗菌肽的肽链较短，增加了提取难度，人工合成抗菌肽则提高了药物成本。（2）抗菌肽的短肽链和简单结构，使其稳定性较差。（3）抗菌肽是一种异种蛋白，可能诱发患者产生一系列的免疫反应和毒性作用。

目前，抗菌肽还处在研究阶段，其作用机制尚未完全明确，但其抗菌谱广，具有不产生耐药性的优势，且不同的抗菌肽具有各自的特点。上述特点使抗菌肽具有成为未来治疗MRSA肺炎的重要抗菌物质的潜力。

[1] Chen K，Huang Y，Song Q，et al.Drug-resistance dynamics of Staphylococcus aureus between 2008 and 2014 at a tertiary teaching hospital，Jiangxi Province，China[J]. BMC Infect Dis，2017，17（1）：97.

[2] Bunnell KL，Zullo AR，Collins C，et al.Methicillin-resistant staphylococcus aureus pneumonia in criticallyⅢtrauma and burn patients：a retrospective cohort study[J]. Surg Infect，2017，18（2）：196-201.

[3] Huang HN，Pan CY，Rajanbabu V，et al.Modulation of immune responses by the antimicrobial peptide，epinecidin（Epi）-1，and establishment of an Epi-1-based inactivated vaccine[J].Biomaterials，2011，32（14）：3627-3636.

[4] Uehara Y，Takahashi M，Murata M，et al.Surfactant protein A（SP-A）and SP-A-derived peptide attenuate chemotaxis of mast cells induced by human β-defensin 3[J].Biochem Biophys Res Commun，2017，485（1）：107-112.

[5] Toke O.Antimicrobial peptides：new candidates in the fight against bacterial infections[J].Biopolymers，2005，80（6）：717-735.

[6] Zouhir A，Jridi T，Nefzi A，et al.Inhibition of methicillinresistant Staphylococcus aureus（MRSA）by antimicrobial peptides（AMPs）and plant essential oils[J].Pharm Biol，2016，54（12）：3136-3150.

[7] Hancock RE，Sahl HG.Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies[J].Nat Biotechnol，2006，24（12）：1551-1557.

[8] Rahman MS，Choi YH，Choi YS，et al.Glycin-rich antimicrobial peptide YD1 from B.amyloliquefaciens，induced morphological alteration in and showed affinity for plasmid DNAof E.coli[J].AMB Express，2017，7（1）：8.

[9] Nijnik A，Hancock RE.The roles of cathelicidin LL-37 in immune defences and novel clinical applications[J].CurrOpin Hematol，2009，16（1）：41-47.

[10] Yang D，Chertov O，Oppenheim JJ.Participation of mammalian defensins and cathelicidins in anti-microbial immunity：receptors and activities of human defensins and cathelicidin（LL-37）[J].J Leukoc Biol，2001，69（5）：691-697.

[11] Chen X，Niyonsaba F，Ushio H，et al.Synergistic effect of antibacterial agents human beta-defensins，cathelicidin LL-37 and lysozyme against Staphylococcus aureus and Escherichia coli[J].J Dermatol Sci，2005，40（2）：123-132.

[12] Dürr UH，Sudheendra US，Ramamoorthy A.LL-37，the only human member of the cathelicidin family of antimicrobial peptides[J].Biochim Biophys Acta，2006，1758（9）：1408-1425.

[13] Ito T，Katayama Y，Hiramatsu K.Cloning and nucleotide sequence determination of the entire mec DNA of premethicillin-resistant Staphylococcus aureus N315[J].Antimicrob Agents Chemother，1999，43（6）：1449-1458.

[14] Liu B，Huang H，Yang Z，et al.Design of novel antimicrobial peptide dimer analogues with enhanced antimicrobial activity in vitro and in vivo by intermolecular triazole bridge strategy[J].Peptides，2017，88：115-125.

[15] Wiesner J，Vilcinskas A.Antimicrobial peptides：the ancient arm of the human immune system[J].Virulence，2010，1（5）：440-464.

[16] Srivastava S，Kumar A，Tripathi AK，et al.Modulation of anti-endotoxin property of Temporin L by minor amino acid substitution in identified phenylalanine zipper sequence [J].Biochem J，2016，473（21）：4045-4062.

[17] Mulder KC，de Lima LA，Aguiar PS，et al.Production of a modified peptide clavanin in Pichia pastoris：cloning，expression，purification and in vitro activities[J].AMB Express，2015，5（1）：129.

[18] Fritz JH，Brunner S，Birnstiel ML，et al.The artificial antimicrobial peptide KLKLLLLLKLK induces predominantly a TH2-type immune response to co-injected antigens[J].Vaccine，2004，22（25/26）：3274-3284.

[19] Zhao XP，He SW，Yue B，et al.Molecular characterization，expression analysis，and bactericidal activity of the derivative peptides of TFPI-1 and TFPI-2 in half-smooth tongue sole，Cynoglossus semilaevis[J].Fish Shellfish Immunol，2016，58：563-571.

R536.1；R974

A

1001-0408（2017）23-3302-04

2017-03-13

2017-04-21）

（编辑：陶婷婷）

广东省自然科学基金项目（No.2016A030313620）；南方医科大学国家级、省级、校级大学生创新创业训练计划项目（No.201612121002）

＊本科生。研究方向：临床医学。电话：0757-27337063。E-mail：906261642@qq.com

#通信作者：副主任医师，副教授。研究方向：慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺癌及肺部感染的诊治。电话：020-62782296。E-mail：chen_xin1020@163.com