基于Meta分析构建抗玉米粗缩病的染色体单片段代换系

宝华宾，梁帅强，林 峰

(1.南京农业大学 农学院，江苏 南京 210095；2.江苏省农业科学院 农业生物技术研究所，江苏省农业生物学重点实验室，江苏 南京 210014)

基于Meta分析构建抗玉米粗缩病的染色体单片段代换系

宝华宾1，2，梁帅强2，林 峰2

(1.南京农业大学 农学院，江苏 南京 210095；2.江苏省农业科学院 农业生物技术研究所，江苏省农业生物学重点实验室，江苏 南京 210014)

为发掘玉米粗缩病抗性基因，解析其遗传规律。借助IBM2 2008 Neighbors遗传图谱，整合已报道的92个抗玉米粗缩病QTLs(Quantitative trait locus)，通过Meta分析获得24个“一致性”抗病区间。利用生物信息分析，确定抗病区段的物理位置信息，在相关区段对郑58和齐319的全基因组重测序序列分析鉴定出7 142个InDel位点，其中546个含有InDel位点的序列可用于引物开发，进一步通过试验筛选出在郑58和齐319第2，4，5，6，7，8，10号染色体上的多态InDel位点158个。以抗粗缩病玉米自交系齐319为供体亲本，感病优良自交系郑58为受体亲本，利用上述InDel标记辅助选择构建整套染色体单片段代换系材料。为抗玉米粗缩病QTL位点的精细定位提供了可能，也为抗病育种提供新的种质资源。

玉米；粗缩病；Meta分析；染色体单片段代换系

玉米粗缩病是由植物病毒引起的病害，导致玉米植株矮化、叶片短宽肥厚、产量明显下降，已成为我国玉米生产区的主要病害之一[1]，严重制约我国玉米生产，因此，开展对玉米粗缩病的研究具有十分重要的意义。解析粗缩病抗性遗传规律，发掘抗性基因，可为玉米抗粗缩病育种提供理论基础。

迄今为止，除第3，9号染色体外，玉米的其余染色体上鉴定出抗粗缩病QTL数量均较多[1-20]，王飞[1]利用掖478×90110构建的F2群体，150个单株通过SSR-BSA分析，检测出4个与粗缩病抗性基因连锁的标记：umc1656(bin6.02)、umc1401(bin7.02)、bnlg1823(bin8.07)和umc1268(bin8.07)。商伟等[14]利用80007×80044构建重组自交系，以205份单株的F5群体结合完备区间作图法(Inclusive composite interval，ICIM)定位到7个QTL，分布在第1，2，5染色体上。石明亮等[15]借助GY220×1145杂交衍生的重组自交系群体，以109个单株的F10：11家系采用复合区间作图法(Composite interval mapping，CIM)发现在第4号染色体上存在5个抗粗缩病的QTL。但是，由于群体大小、群体类型、试验环境、统计方法不同，上述研究定位的区域较宽，难以找到与抗病QTL紧密连锁的分子标记；同时由于多采用初级群体，定位精度较差，导致无法真实客观地评价每个QTL解释的遗传差异。

随着生物信息学和比较基因组学等新兴学科的快速发展，以及高密度IBM遗传图谱构建，通过建立数学模型，对来自不同试验QTL置信区间优化的“元分析(Meta-analysis)”方法已广泛应用。王毅等[21]将收集到的127个控制玉米株高的QTL进行优化，获得40个“真实”QTL。江培顺等[22]整合了1994-2012年文献发表的玉米产量性状(穗行数、行粒数、粒重)584个QTL，采用元分析方法，确定22个穗行数、7个行粒数和44个粒重Meta-QTLs。刘红军等[23]通过映射不同试验中的340个玉米抗病QTL，采用元分析技术，在1，3，6，10号染色体上发掘5个“一致性”抗病QTL区间。

本研究系统整理了2006-2015年文献发表的抗玉米粗缩病定位相关信息，将不同作图群体的QTL映射到IBM2 2008 Neighbors参考图谱上，采用元分析方法获得了抗玉米粗缩病24个Meta-QTLs。根据Meta-QTL两端标记和QTL定位信息开发InDel标记构建以抗粗缩病玉米自交系齐319为供体亲本、感粗缩病优良自交系郑58为受体亲本的染色体单片段代换系。借助这套代换系材料，为玉米粗缩病抗性QTL位点精确定位、克隆以及抗病育种奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料及染色体单片段代换系群体的构建

所用材料为抗粗缩病玉米自交系齐319与感粗缩病优良自交系郑58，以齐319为供体，郑58为受体，通过前景选择和背景选择，连续回交4代，共获得138个BC4F1株系。从2013年开始种植，3月种植于江苏省农科院六合实验田，7月收获后在六合加代，11月种植于海南三亚继续加代，每个株系种植3粒，行长2 m，行宽40 cm，每行种3个株系共播种9粒。整体构建方案如图1所示：

斜体部分表示通过MAS(Marker-assisted selection)筛选。The italic body denotes the process of MAS.

1.2 抗玉米粗缩病QTL信息收集和整理

收集2006-2015年发表在国内外主要刊物上的抗玉米粗缩病QTL相关信息，主要包括作图群体大小、群体类型、染色体位置、LOD值、遗传贡献率、置信区间、加性效应、遗传图谱标记和遗传距离等。对收集的QTL信息按照BioMercator 4.2软件[24]要求格式整理，将图谱名称、群体大小、群体类型、QTL所在连锁群、QTL名称、位置、遗传贡献率、性状、LOD值及加性效应值载入到每个原始图谱中。

1.3 抗玉米粗缩病QTL的映射和Meta分析

将各个原始图谱与参考图谱上相关标记载入BioMercator 4.2软件，构建图谱库，通过Analyses-Map compilations-Map compilation(ConsMap)和Analyses-Map compilations-QTL projection(QTLProj)功能将每个原始图谱中的QTL映射到参考图谱上，建立一致性图谱(Consensus map)；确定最小AIC值模型后，再借助Analyses-QTL meta-analyses-Meta-analysis 1/2(Veyrieras)和Analyses-QTL meta-analyses-Meta-analysis 2/2(Veyrieras)功能完成Meta分析。

1.4 Meta-QTL及相关区域InDel标记的挖掘与开发

通过NCBI和玉米基因组数据库收集Meta-QTL及因缺少信息而未成功映射的QTL两端标记序列信息，与B73 v3基因组序列(www.maizesequence.org)比对，筛选出郑58及齐319各QTL区段的序列。通过mInDel(https：//github.com/lyd0527/mInDel)程序搜索特定区段的InDel信息。借助Primer 3[25]设计引物，利用ePCR软件(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/e-pcr/)通过在两亲本间模拟PCR扩增进而分析标记位点的多态性[26]。

1.5 PCR扩增和基因型检测

对群体全部单株及亲本取样，用低温真空干燥仪干燥及植物组织研磨器打碎后，采用Karroten试剂盒抽提叶片DNA。PCR反应体系为25 μL，包含2 μL(50 ng/μL)模板DNA，2 μL(1 μmol/L)两侧引物，2.5 μL 10×Buffer(含 MgCl2)，2.5 μL dNTP(1 mmol/L)，1 UTaq聚合酶和15.9 μL ddH2O，上覆20 μL矿物油。94 ℃预变性3 min；35个扩增循环：94 ℃变性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min；72 ℃延长5 min；4 ℃保存。2%琼脂糖凝胶上加压120 V对扩增产物分离，溴化乙锭染色，凝胶成像仪上观察并记录。

2 结果与分析

2.1 抗玉米粗缩病QTL相关信息收集

共搜集20余篇抗玉米粗缩病QTL定位的文献[1-20]，获得92个抗玉米粗缩病QTL相关信息，主要分布在1，2，4，5，6，7，8染色体上(表1)；以及12个因缺少加性效应值或遗传贡献率而未成功映射的QTL定位信息。

表1 已报道的抗玉米粗缩病QTLs Tab.1 QTLs published associated with MRDD resistance in maize

2.2 抗玉米粗缩病Meta-QTLs分析

对成功映射的92个QTL进行分析，获得24个Meta-QTLs，遍布玉米的10条染色体，其中在第1，6，8号染色体上较为集中，分别有4个；第2染色体上各有3个，第4，5，7染色体上各有2个。另外，在第3，9，10染色体也分别有1个Meta-QTL(图2)。

2.3 Meta-QTLs及相关区域InDel标记的发掘与开发

利用24个Meta-QTLs两端序列信息以及12个未成功映射QTL的位置信息与B73基因组序列比对确定其物理位置(表2，3)。根据郑58和齐319的二代测序后的电子拼接序列在相关区段发现7 142个InDel位点，其中约有546个含有InDel位点的序列可用于特异引物的开发。通过试验筛选出在亲本郑58和齐319间有多态且能够清晰分辨杂合个体的标记158个，分布在第2，4，5，6，7，8，10号染色体上，根据其基因组物理位置绘制多态InDel位点的染色体分布图(图3)。

图2 抗玉米粗缩病QTL一致性图谱Fig.2 Consensus map of QTL for MRDD resistance

引物名称Primersname正向引物序列Forwardprimersequence反向引物序列Reverseprimersequence染色体Chr．物理位置/bpPhysicallociIDP755GCAGTTTGCACATCTCATGCTTCTCTGGTAGACGCGAAGC15287604umc1166CGATCAGATCATACACAACCTTGCGAGGATCGATTCTTGGCGAGT115080522IDP180CATGCCAATTTCTCTCACAGCCGTTCTCTTTGTCTCCTGGC135776205IDP4441GGCGTAGTATTGTTCGAGCCGCATGTAGGCATGTAGCAGC153007367umc1919aTAAATCTGAGCCAGTCATAAGGGCAGCAGAATAAAGTACGGTAGAGGTGG1191891247umc1335ATGGCATGCATGTGTTTGTTTTACACAGACGTCGCTAATTCCTGAAAG1197106214umc1278GTCGGAGGATGATCCCCTATCTATTGCCATAGTACATGTCCGTCATTC1215259261TIDP5626AGCAGAGGACCATGAAGTGGGATCAGCAGCTTGAAGGAGG1231219002TIDP5256CCCAAAGAAACTAACTCGGCTGGTTACCTTCGGAAGAACG21559901umc1635GCTGAGCAGATCTTTCCTTGTTTCAAGGAGCAGAACTCGGAGACG28412230TIDP7075ACAATGGTGGACTCCTTTCGTGTGCCTTTAGCATCTCACG216360096umc2195CTCTCGGCTTCTTCTACACGCTACATCCTTGACGATGAAGTCGTGG219242937IDP5862TGTCAATCAGAAACAAGCGGGTAGCACAGCGACACAGAGG2219255430TIDP5264TTCTTGCTCGAAATGACGGCACATGATCCCTGAGAATGC2227039851IDP6021ATCGTCACTTCACCATCAAGCACGTGGATCAAGGTCGTAGC3161296412IDP149CCGACAAATTTGCCATATCCCTTTCAGAGCTTACCTGCCG3187107513IDP1667GTGAATACGCCGTGGAGGTTAGGCTTTAGTTCCGCACC4157583799TIDP7116AGCTTCATGTACGGAGGAGGATAACACGACCAAGCGTTCC4169587731

表2(续)

表3 未成功映射QTLs位置信息Tab.3 The physical location of QTLs unprojected

2.4 染色体单片段代换系群体鉴定与获得

以抗粗缩病玉米自交系齐319为供体亲本，感病自交系郑58为受体亲本，利用上述158个InDel标记对208个BC1F1个体检测，当样本的琼脂糖凝胶电泳条带表现多态且为双亲互补类型的条带时，即该位点存在代换片段；当表现出单一条带且与郑58相同时，判定该InDel标记所在区段为纯合片段；当表现多态且与郑58和齐319互补基因型不同时，判定为外来花粉污染[27]，最后筛选出158个与双亲基因型互补的BC1F1种子(图4)。连续对回交群体前景筛选，因发芽和田间管理因素导致部分材料缺失，对收获的138个BC4F1个体再次前景筛选，以及通过背景筛选发现杂合位点数量多为1～3个(图5)，代换片段覆盖基因组长度约为761.8 Mb，覆盖率约为37.0%。

3 讨论

随着分子标记辅助选择技术的快速发展，该技术对多种作物产量性状遗传改良已取得一定成果[28-30]，但由于受到数量性状基因的表达与互作，亲本及群体大小不同、环境和统计方法等诸多因素的差异，控制同一性状的QTL存在差异；同时由于多采用初级群体，定位精度和重复性较差，导致无法真实客观地评价每个QTL解释的遗传差异。因此，本试验在整合不同研究中抗玉米粗缩病QTL信息基础上，采用Meta分析缩小QTL置信区间，提高定位的准确度和有效性[31]，进而针对Meta-QTLs区间设计引物构建抗玉米粗缩病的染色体单片段代换系。

图3 158个InDel标记在染色体上的分布Fig.3 Chromosome locations of 158 InDel markers

1，2.父本和母本条带；3～13.BC1F1群体样本条带；5，13.双亲互补条带，其余条带和母本一样。1，2.Bands of a father and mother；3-13.Bands of BC1F1 generation individuals；5，13.Band of hybrids of parents，else same with mother.

图5 32个InDel标记在BC4F1个体上琼脂糖凝胶检测结果Fig.5 The electrophoresis of 32 InDel markers amplified in BC4F1 individuals

因单片段代换系是只含有1个代换片段的代换系，群体内的任何差异是由代换片段造成的，利用其进行遗传分析可以排除遗传背景的干扰，将相关基因准确定位在染色体上。朱金燕等[32]以广陆矮4号为受体和日本晴为供体的85个染色体片段代换系系为试验材料，对水稻穗粒数鉴定，检测到27个控制穗粒数的QTL。陈春侠等[33]基于59份染色体单片段代换系纯合体对玉米百粒质量性状进行2年6个试验环境的表型鉴定，共检测出20个百粒质量QTL，分布在玉米的8条染色体上。陶亚军等[34]利用籼稻品种广陆矮4号为受体和粳稻品种日本晴为供体构建的84个染色体单片段代换系群体为材料，共检测到36个垩白相关QTL，其中垩白度QTL 19个。

在染色体单片段代换系构建过程中，为提高构建效率，前期使用尽可能多的标记对适当大小群体进行筛选，并选择背景恢复率高的单株[35]。本研究通过对抗粗缩病相关位点挖掘的158个InDel标记对208个BC1F1样本进行筛选，进而通过多次回交建立一套单片段代换系。借助构建的这套代换系材料可对玉米粗缩病抗性QTL精细定位和克隆，研究某个QTL位点效应值的大小和不同QTL位点互作对抗性的贡献，区分有利的等位基因和不利的等位基因，以及对玉米粗缩病的抗病育种起到重要作用。

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Construction of Single Segment Substitution Lines Confer Resistance to Maize Rough Dwarf Disease Based on Meta-analysis

BAO Huabin1，2，LIANG Shuaiqiang2，LIN Feng2

(1.College of Agriculture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2.Institute of Agro-biotechnology，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Agricultural Biology of Jiangsu Province，Nanjing 210014，China)

On the basis of the high-density linkage map of maize IBM2 2008 Neighbors，92 QTLs (Quantitative trait locus) associated with maize rough dwarf disease were collected and an integrated QTL map were constructed.By using Meta-analysis，24 Meta-QTLs were predicted and their physical locations were estimated through bioinformatics analysis.Based on the whole genome resequencing of two maize inbred line Qi 319 and Zheng 58，7 142 InDel loci were identified at the Meta-QTL region and 546 pairs primers were designed for PCR analysis.Finally 158 InDel markers were screened for their polymorphism between Qi 319 and Zheng 58，and distributed on chromosome 2，4，5，6，7，8，and 10，respectively.With these InDel marker assisted selection，a series of SSSLs(Single segment substitution lines) were constructed by introduce these QTLs from resistant maize line Qi 319 (Donor parent) into the susceptible line Zheng 58(Recipient parent).These SSSLs will be benefit for fine-mapping of QTLs associated with maize rough dwarf disease and also provide new resources for resistance breeding.

Maize；Maize rough dwarf disease；Meta-analysis；Chromosome single segment substitution lines

2016-06-10

江苏省自然科学基金项目(BK20141385)；江苏省农业科技自主创新资金项目(CX(14)5054)

宝华宾(1989-)，男，河南焦作人，硕士，主要从事玉米遗传育种研究。

林 峰(1978-)，男，山东聊城人，副研究员，博士，主要从事玉米遗传育种研究。

Q78；S435

A

1000-7091(2016)06-0056-07

10.7668/hbnxb.2016.06.009