转AtHDG11基因玉米的获得及抗旱性鉴定

南芝润，侯 磊，刘 霞，焦雄飞，焦改丽，吴慎杰

(1.山西省农业科学院 玉米研究所，山西 忻州 034000；2.山西省农业科学院 棉花研究所，山西 运城 044000)

转AtHDG11基因玉米的获得及抗旱性鉴定

南芝润1，侯 磊1，刘 霞1，焦雄飞1，焦改丽2，吴慎杰2

(1.山西省农业科学院 玉米研究所，山西 忻州 034000；2.山西省农业科学院 棉花研究所，山西 运城 044000)

培育抗除草剂和抗旱的转基因玉米种质，通过超声波辅助农杆菌介导花粉非组培法将拟南芥抗旱基因AtHDG11导入玉米自交系昌7-2中，获得转基因植株。通过逐代除草剂筛选、分子检测对获得的转基因植株进行检测，获得5株转基因株系。在此基础上，以非转基因自交系昌7-2为对照，对5个转基因株系进行抗旱性鉴测；对苗期和十叶期玉米植株进行干旱胁迫处理，测定转基因植株生理活性物质和光合参数。结果表明，在干旱胁迫条件下，转基因玉米叶片的Pro含量高于非转基因玉米，MDA含量低于非转基因玉米；不论在正常生长条件下还是干旱条件下，转基因株系的光合速率和水分利用率都明显高于对照植株；而转基因株系的蒸腾速率和气孔导度则明显低于对照植株。综合室内与田间的抗旱检测结果表明，超声波辅助农杆菌介导花粉的非组培转基因方法在玉米上是可行的。将拟南芥HDG11基因导入玉米，同样可以有效地提高玉米的抗旱性，为玉米的抗旱育种提供新的种质资源和新的转基因方法。

玉米；抗旱性；AtHDG11；遗传转化

玉米是世界上三大作物之一，是主要的粮食、饲料作物和重要的工业原料。提高玉米产量一直以来都是育种家们努力的目标，然而，在植物的生长过程中，经常会面临干旱、 涝害、 盐碱、 高温、 低温、 冷害、 营养匮乏、 重金属污染等非生物胁迫，严重影响了植物的正常生长和发育。在这些逆境胁迫中，干旱是最为突出的限制因素之一[1]。据统计，每年干旱导致作物减产达50%以上[2]，而玉米是对水分胁迫比较敏感的作物之一，干旱是影响玉米产量提高的重要因素之一。

AtHDG11是拟南芥HD-START 转录因子家族成员之一。 拟南芥中共有16个HD-START 转录因子，这些转录因子在拟南芥的正常生长发育过程中充当中心调节因子[3]。过量表达HDG11基因的转基因植株增强了的多个特征与耐旱性相关，包括增强根系生长和降低气孔密度。目前，该基因已在拟南芥、烟草[4]、水稻[5]、马铃薯[6]、高羊茅[7]、黑麦草[8]、棉花和杨树[9]中得到证实。过量表达该基因能增强植物的干旱胁迫能力，在改善植物抗旱和耐盐性上有很好的效果。迄今为止，尚未见转HDG11玉米的相关研究报道。

本研究通过超声波辅助农杆菌介导花粉非组培法，将外源基因AtHDG11导入玉米自交系中，获得了转基因玉米植株，证明超声波辅助农杆菌介导花粉非组培法在玉米转基因研究上的可行性；比较了干旱胁迫下转基因和非转基因玉米中的游离脯氨酸含量、MDA含量以及光合参数，初步证实来源于拟南芥的HDG11基因在玉米中同样具备抗旱耐逆的生理功能，这对培育玉米抗旱新品种具有一定的科研参考价值。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以玉米(Zeamays)自交系昌7-2为受体试材；农杆菌菌株为LB4404。植物表达载体pCB2004-AtHDG11由中国科学技术大学向成斌教授提供。T-DNA区结构如图1 所示。

图1 质粒 pCB2004-AtHDG11的 T-DNA 区Fig.1 T-DNA region of plasmid pCB2004-AtHDG11

1.2 转化方法

1.2.1 农杆菌的准备 携带pCB2004-AtHDG11质粒载体的农杆菌菌株 28 ℃悬浮培养 16～24 h 后，离心并用液体培养基(含10%～15%蔗糖)重悬稀释至 OD600为 0.8～1.0备用。

1.2.2 花粉准备 供试玉米自交系昌7-2于7月上、中旬开花抽丝前，将其雌穗套袋隔离。待盛花期收集10：00-12：00开花的玉米花粉，于4 ℃冰箱中冷冻处理2 h。将处理过的花粉溶于经过通气和低温处理的浓度为10%～20%的蔗糖溶液中，超声波处理(声强100～200 W，工作时间为5 s，间隔6 s，工作次数6次)，处理后将花粉悬浮液稍静置后倒掉上清液。

1.2.3 转化处理 以农杆菌悬浮液为基因供体，以处理后的花粉为受体，以一定比例将花粉和农杆菌混合，同时加入100 μmol/L乙酰丁香酮，静置处理5～15 min后，倒掉上清液，用细毛笔刷将沉淀的处理花粉授到植物柱头上，并套袋挂牌标记。2 d后再重复处理1次，利用农杆菌将目的基因整合于植物基因组中。待转化的植物籽粒成熟后收获，在随后的生长季播种于大田，利用筛选标记基因筛选，即可获得转基因植株。

1.3 转基因玉米的鉴定

1.3.1 T0种子除草剂初步筛选 将收获的T0玉米种子表面消毒后种植在含0.05%草胺膦的固体1/2 MS培养基上进行筛选，14 d后统计玉米的生长情况。结果显示，转基因植株正常生长，叶片为绿色，非转基因植株发芽后茎尖开始褐化并停止生长，将筛选出来的阳性植株移栽到花盆中，为进一步试验做准备。

1.3.2 PCR检测 采用CTAB法提取转基因玉米植株和对照植株的基因组DNA[10]。以基因组DNA为模板，用AtHDG11基因的上游引物5′-CGGTGGTG GTAGTCATCAT-3′和下游引物5′-CGCCTTTAGTAGC AACACG-3′进行基因组PCR分析，预计扩增片段大约为 1 014 bp。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

AtHDG11基因PCR扩增程序为：94 ℃ 预变性 5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 延伸 10 min。扩增PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，拍照。确定AtHDG11基因是否插入转基因玉米的基因组中。

1.3.3AtHDG11在转基因玉米中的表达分析 初步确定为阳性的T1植株，取其叶片，提取叶片总 RNA。使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。以cDNA 为模板进行 PCR扩增。

用天根公司提供的RNAprep pure Plant Kit试剂盒提取T1转基因和非转基因玉米叶片组织总RNA，取5 μg的总RNA，用反转录试剂盒(SuperRT cDNA Kit)反转录合成20 μL的cDNA。以cDNA为模板，用AtHDG11的上游特异引物5′-CGGTGGTGG TAGTCATCATCA-3′和下游引物5′-ACTGTGGAGG TCCTCCTGTTA-3′进行RT-PCR扩增，扩增片段预计为340 bp。考察转基因玉米叶片中AtHDG11的转录水平。用GADPH为内参，扩增GADPH的cDNA所用的上游引物5′-AGCAGGTCGAGCATCTTCG-3′和下游引物5′-CTGTAGCCCACTCGTTGTC-3′，RT-PCR反应采用第一链cDNA作为模板，扩增内参基因用30个循环，扩增AtHDG11的cDNA也用30个循环。

1.4 转基因玉米的苗期抗旱性鉴定

播种于花盆的T2玉米植株在正常浇水条件下长至16 d，选取大小长势一致的5个株系进行干旱控水处理，干旱处理10 d后恢复正常浇水，分别在干旱处理的第 0，4，6，10天取相同部位的叶片进行丙二酮(MDA)、游离脯氨酸(Pro)含量的测定。Pro含量的测定采用酸性茚三酮法[11]；MDA含量的测定采用TBA法[12]。

1.5 转基因玉米的田间抗旱性鉴定

将T2转基因玉米种子和受体自交系种子种植于大田，在植株长到10片叶时测定植株的净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、水分利用率(WUE)。测定方法参照泽泉CI-340超轻型便携式光合作用测定仪说明书进行。选取5个株系进行测定，每个株系测5株，设3个重复。

2 结果与分析

2.1 转基因玉米的获得

在玉米盛花期，利用超声波辅助农杆菌介导花粉非组培法将外源基因AtHDG11导入受体材料自交系昌7-2中，共处理玉米雌穗500穗，获得T0种子292粒。

2.2 转基因玉米植株的分子鉴定

2.2.1 PCR检测AtHDG11的玉米经草胺膦筛选后得抗性苗28株，经驯化、移栽后成活14株(图2)。待T1抗性苗生长5～6片叶时，全部取样并提取总DNA进行PCR检测(图3)。对AtHDG11基因PCR检测结果显示，抗性株5株呈阳性，即部分除草剂草胺膦抗性的植株是非转基因的。这5株阳性株初步被确认为转基因阳性株。

2.2.2 RT-PCR 检测 为了确定AtHDG11在转基因植株中的转录情况，提取叶片RNA，反转录获得cDNA，利用RT-PCR对初步确定为阳性的植株进行进一步检测。选用GADPH的表达强度为内标。从图4可以看出，AtHDG11基因不仅被整合到玉米基因组中，而且还能正常转录，表达水平因株系不同而差异较大。

图2 转基因玉米在含0.05%草铵膦培养基上的抗性表现Fig.2 Herbicide resistance of transgenic plants suffered from 0.05% glufosinate-ammonium

M.DL2000 DNA Marker；1～5.转基因植株；-.空白对照；CK.昌7-2；+.阳性对照(质粒 DNA)。图4同。M.DL2000 DNA Marker；1-5.Transgenic plants；-.Blank control；CK.Chang 7-2；+.Positive control(plasmid DNA).The same as Tab.4.

图4 T1转基因玉米植株的 RT-PCR 检测结果Fig.4 RT-PCR analysis of T1 transgenic plants

2.3 转基因与对照玉米植株在干旱胁迫下MDA和Pro含量的变化

脯氨酸是植物受到逆境胁迫后产生的最常见和最有效的渗透调节物质，植物通过渗透调节作用保持细胞内的水分，避免或减轻逆境对其伤害，脯氨酸含量与植物抵抗逆境的能力成正比[13]。植物中脯氨酸含量是抗逆研究的常用指标[14]。由图5-A可知，在干旱胁迫的每个时间段，5个转基因株系与对照植株的Pro含量均呈上升趋势，但是转基因植株无论是Pro的绝对含量还是相对增加程度都明显高于对照植株，表明转基因玉米受到的伤害较小，具有更强的抗旱性。由图5-B可知，对照植株与转基因植株相比，MDA(以鲜质量计)积累量较高，说明对照植株受伤害的程度更大。表明在干旱胁迫下，转AtHDG11基因玉米能更好地免受氧化损伤，具有更强的抗旱性。

图5 转基因和对照玉米植株干旱胁迫处理过程中Pro和MDA含量变化Fig.5 Chang of Pro content and MDA content in transgenic maize plants and control plants during the drought stress tolerance

2.4 干旱胁迫对玉米转基因植株光合参数的影响

光合作用是植物体内至关重要的代谢过程，其强弱对植物的抗逆性有重要影响，因而，光合参数可以作为衡量植物抗逆性强弱的重要指标[15]。由图 6可知，不论在正常生长条件下还是在干旱条件下，转基因株系的光合速率和水分利用效率都明显高于对照植株；而转基因株系的蒸腾速率和气孔导度则明显低于对照植株。在整个干旱胁迫过程中，转AtHD11株系能够维持较高的光合速率和水分利用效率，保持较低的蒸腾速率和气孔导度，表明转AtHD11植株在干旱胁迫中受损伤程度较轻。

图6 干旱胁迫对玉米叶片光合参数的影响Fig.6 Effects of drought stress on photosynthetic parameters of maize leaves

3 讨论与结论

超声波介导花粉转化法是一个简单易行的基因转导方法[16]，但该方法的主要缺点之一是不能很好地转化大片段的DNA，DNA片段越大转化的效率越低，且遗传稳定性越差，可能是由于DNA片段没有自主性，不能实现外源基因自主向植物细胞转移并且整合，导致转化率低且遗传稳定性较差。农杆菌作为一种天然的植物基因转化系统，具有能够转移大的DNA片段、 整合位点较稳定、外源基因重排少等优点，外源基因多以单或寡拷贝整合，并能稳定遗传，其在玉米遗传转化中已有很多报道[17-19]。 超声波辅助农杆菌介导花粉的非组培转基因方法是在超声波介导花粉转化法的基础上，将没有自主性的DNA携带载体替换成有自主结合能力的农杆菌，这样既可以提高转化大片段DNA植株的结实率、稳定性，又避免了冗长繁琐的植物组培过程。该方法经过笔者3年的试验研究，揭示了其可行性。2013年通过超声波辅助农杆菌介导花粉的非组培转基因方法，将AtHDG11基因导入玉米自交系昌7-2中，共处理500株，分5个批次；2014年处理500株，分5个批次；2015年处理300株，分3个批次。2013年得到292粒种子；2014年收获籽粒数295粒；2015年收获230粒种子。经PCR分析鉴定，2013年有5株表现为阳性；2014年有14株表现为阳性；2015年有28株表现为阳性。随着技术参数的不断改进，阳性率越来越高，从2013年的1.7%增至2015年的12%。

干旱胁迫明显地影响了农作物的生长和生产力。因此，改进作物品种的抗旱性至关重要和紧迫，转基因的方法已被证明可以加速作物改良[20-22]。关于AtHDG11抗旱性研究表明，转AtHDG11基因能够增强植物对干旱的耐受性。转基因植株改善的多个特征与耐旱性相关，如降低转基因植株的气孔密度、发达的植株根系、较高水平的SOD和CAT活性等。本试验将AtHDG11转入玉米，获得了具有抗旱性状的玉米新品种。选取Pro含量、MDA含量[23-24]和光合参数这几个与抗旱密切相关的生理生化指标，以评价转基因植株的抗旱性，试验结果表明，在干旱胁迫下，转AtHDG11 玉米通过提高WUE，维持较强的光合能力，较高的脯氨酸含量和较低水平的丙二酮含量等提高了玉米的抗旱性。同时也证明超声波辅助农杆菌介导花粉非组培法的可行性。

关于转AtHDG11 基因在玉米干旱胁迫中的表达调控功能有待进一步研究，以明确其在玉米干旱逆境胁迫下的调控机制，为研究玉米的耐旱分子机制及基因工程提供科学依据，为培育耐旱玉米新品种奠定良好的基础。

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Expression of AtHDG 11 in Transgenic Maize and Drought Resistance Identification

NAN Zhirun1，HOU Lei1，LIU Xia1，JIAO Xiongfei1，JIAO Gaili2，WU Shenjie2

(1.Institute of Maize，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Xinzhou 034000，China； 2.Cotton Research Institute，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Yuncheng 044000，China)

The objective of this experiment is to study the production of transgenic maize with the resistance of drought stress.In this study，an expression vector containing drought resistance geneAtHDG11 was used to transform to maize elite inbred line Chang 7-2 by ultrasonic assistedAgrobacteriummediated pollen transformation method，and produced transgenic maize plants.Based on herbicid resistance，PCR analysis and transcriptional analysis，five transgenic maize lines were selected from a large number of transgenic lines.Subsequently，the inbred line Chang 7-2 was used as the nontransgenic control to analyze the drought resistance of transgenic plants.Physiological active substances and photosynthetic parameters were measured on plants at the seedling stage and 10-leaf stage in a drought stress treatment.The results showed that Pro content of transgenic maize was higher than that of the CK plants under drought stress conditions，while MDA content was lower.Both normal conditions and drought condition，photosynthetic rate and water use efficiency of transgenic lines were significantly higher than that of CK plants.And transpiration rate and stomatal conductance of transgenic lines were significantly lower than the control plants.Therefore，ultrasonic assistedAgrobacteriummediated pollen transformation method is feasible in the maize.AtHDG11 is a strong biotechnological candidate for use in efforts to produce a drought-resistance maize.This study will provide new germplasm resources and new transgenic method.

Maize；Drought resistance；AtHDG11；Transformation

2016-07-06

山西省农业科学院育种基础项目(yyzjc1413)

南芝润(1979-)，女，山西运城人，助理研究员，硕士，主要从事玉米转基因育种研究。

吴慎杰(1971-)，男，山西运城人，副研究员，博士，主要从事棉花转基因育种研究。

S332.4

A

1000-7091(2016)06-0063-05

10.7668/hbnxb.2016.06.010