小鼠FABP4基因启动子驱动红色荧光蛋白载体的构建及在牛体细胞中的表达

岳永莉，于海泉

(内蒙古大学 哺乳动物生殖生物学及生物技术教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010021)

小鼠FABP4基因启动子驱动红色荧光蛋白载体的
构建及在牛体细胞中的表达

岳永莉，于海泉

(内蒙古大学 哺乳动物生殖生物学及生物技术教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010021)

小鼠脂肪型脂肪酸结合蛋白(FABP4)的启动子/增强子元件是脂肪组织特异性启动元件，为了鉴定该元件在牛体细胞中的启动效果，首先以小鼠肝脏DNA为模板，通过PCR克隆得到5.9 kb的FABP4基因启动子片段，连入pMD19-T载体后进行酶切及测序鉴定，经EcoT 22I酶切去除非核心启动子区后精简为2.3 kb的片段，通过SacⅡ酶切将5.9 kb片段和2.3 kb片段的启动子连入红色荧光蛋白载体pDs-Red 2-1的多克隆位点，构建为表达质粒pMF5.9-Red和pMF2.3-Red，利用脂质体法将上述载体分别转染牛脂肪间充质干细胞及牛胎儿成纤维细胞，24 h后实时定量PCR检测红色荧光蛋白转录水平。结果表明，克隆得到的5.9 kb小鼠FABP4启动子片段酶切及测序结果正确，与红色荧光蛋白载体相连的载体pMF5.9-Red和pMF2.3-Red酶切结果与预期相符，表达载体构建成功，实时定量PCR结果显示以上2种细胞在转染后24 h红色荧光蛋白均有表达，且pMF2.3-Red的转录水平是pMF5.9-Red的2倍以上。成功构建了小鼠FABP4启动子驱动红色荧光蛋白表达载体pMF5.9-Red和pMF2.3-Red，5.9 kb片段和2.3 kb片段均可驱动外源基因在牛体细胞中转录，且2.3 kb片段启动效率高于5.9 kb片段。

小鼠FABP4启动子；载体构建；牛体细胞

用组织特异性启动子与增强子作为转录启始元件调控目的基因的表达，是动物基因工程中限定外源基因时空特异性表达常用的手段，在应用上比较成熟的如乳腺特异型(酪蛋白、乳球蛋白)、肌肉特异型(肌动蛋白、肌酸激酶、生肌因子家族)、肝脏特异型(TTR)、生殖细胞特异型(Oct-4)、毛囊特异型(超高硫角蛋白)等启动子，已经有许多成功获得转基因动物的报道[1]。

脂肪组织是机体中重要的能量储存器官，承担着维持体温、保证代谢的正常运转和保护身体及内脏器官免受机械冲击伤害的功能，还是机体重要的内分泌器官，通过分泌激素和细胞因子发挥作用。小鼠脂肪型脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding protein 4，FABP4又称为Adipocyte protein-2，aP2)启动子作为脂肪组织的特异性启动子，与Cre-loxP系统的成功结合，是脂肪细胞特异性基因敲除小鼠的技术基础[2-4]。由于脂肪组织在胚胎发育的后期开始出现，对于胚胎发育以及新生儿的存活具有重要意义，因此，对于基因的胚胎致死问题则可以通过aP2-CreERT2条件敲除小鼠品系来解决[5]。FABP4启动子元件已成功应用于胰岛素耐受[6]、肥胖[7]、肝脂肪变性[8]等疾病治疗及相关基因的研究。

本研究以红色荧光蛋白作为报告基因，对比分析了小鼠FABP4启动子元件 5.9 kb全长和酶切后的2.3 kb片段在牛的脂肪间充质干细胞和牛胎儿成纤维细胞中的启动效率，以期为下一步利用该元件制作转基因牛奠定工作基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

清洁级昆明白小鼠，由内蒙古大学实验动物研究中心提供。DNA提取试剂盒、pMD19-T载体、限制性内切酶、RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、实时定量PCR试剂盒为宝生物工程(大连)有限公司提供，脂质体LTX为Invitrogen公司产品，HifiTransTaq酶为北京全式金生物技术有限公司产品。牛脂肪间充质干细胞、牛胎儿成纤维细胞为本实验室保存。

1.2 载体构建

提取6周龄小鼠肝脏的基因组DNA，利用在两端添加了SacⅡ酶切位点的引物F：5′-CCGCGGAACCTGCTAACGAACTTGACCAT-3′，R：5′-CCGCGGTCCCACAAAGGCATCACACAT-3′进行PCR扩增，反应程序为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸6 min，32个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物进行电泳、胶回收后，与T载体连接，该载体命名为pMF5.9，将pMF5.9载体送宝生物工程(大连)有限公司测序，同时进行酶切鉴定。将pMF5.9进行EcoT 22I酶切后回收5.0 kb片段进行连接，连接后的载体命名为pMF2.3。分别将pMF5.9和pMF2.3用SacⅡ酶切后，分别回收5.9，2.3 kb片段，与同样经SacⅡ酶切的pDsRed2-1载体相连，分别命名为pMF5.9-Red和pMF2.3-Red载体(图1)。

1.3 细胞转染及检测

将第5代的牛脂肪间充质干细胞和牛胎儿成纤维细胞以2×105个/孔的密度接种于6孔板，根据脂质体说明书采用2.5 μg质粒DNA+10 μL LTX的条件转染细胞，24 h后收集细胞，提取总RNA，反转录后进行实时定量PCR检测，反应程序为95 ℃ 30 s，然后是95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。内参基因GAPDH的引物为F：5′-GAPDHTTCAACGGCACAGTCAAG

G-3′，R：5′-ACATACTCAGCACCAGCATCAC-3′，红色荧光蛋白引物为F：5′-CATCCCCGACTACAAG AAGC-3′，R：5′-TGGTCTTCTTCTGCATCACG-3′。

2 结果与分析

2.1 小鼠FABP4启动子扩增

以小鼠肝脏基因组DNA 为模板，成功克隆了全长5.9 kb 的小鼠FABP4启动子/增强子(图2)。经测序得知，克隆片段与GenBank公布的序列同源性为99.3%。经序列分析得知，转录起始位点ATG上游的-311，-1 905，-3 096，-3 476，-3 933 bp位点处存在EcoT 22I酶切位点。

2.2 载体构建

载体构建流程见图1。将2.1中的PCR片段与T载体连接后，提取质粒分别经EcoR Ⅰ与EcoR Ⅴ酶切鉴定，电泳条带符合预期，证明pMF5.9质粒构建成功。将质粒pMF5.9经EcoT 22I酶切后，回收5.0 kb片段进行连接，将连接后载体分别经Hind Ⅲ与EcoR Ⅰ单酶切鉴定，电泳条带符合预期，证明pMF2.3质粒构建成功(图3)。

图1 载体构建示意图Fig.1 Diagram of vector construction

图2 小鼠FABP4启动子PCR扩增Fig.2 Electrophoresis of mouse FABP4 promoter amplification

图3 pMF5.9与pMF2.3质粒的酶切鉴定结果Fig.3 Enzyme digestion result of plasmid pMF5.9 and pMF2.3

分别将质粒pMF5.9和pMF2.3经SacⅡ酶切后的小鼠FABP4启动子片段连入pDsRed2-1载体。将连接成功的质粒pMF5.9-Red和pMF2.3-Red分别进行EcoT 22I、EcoR Ⅴ与Hind Ⅲ、EcoR Ⅴ的酶切鉴定，结果符合预期，证明pMF5.9-Red和pMF2.3-Red质粒构建成功 (图4) 。

图4 pMF5.9-Red 与pMF2.3-Red质粒的酶切鉴定结果Fig.4 Enzyme digestion result of plasmid pMF5.9-Red and pMF2.3-Red

2.3 红色荧光相对表达检测

细胞分别转染pMF5.9-Red和pMF2.3-Red载体后，实时定量PCR检测结果显示，转染pMF2.3-Red质粒后红色荧光蛋白mRNA水平在牛脂肪间充质干细胞中是pMF5.9-Red的2.28倍，而在牛胎儿成纤维细胞中是2.12倍(P<0.05)(图5)。

*.P<0.05。

3 结论与讨论

转基因动物的制作过程中，选择合适的启动子元件是载体构建的重要环节，组成型启动子如CMV或PGK等，虽然可以获得大量目的蛋白，但同时会对动物的正常生命活动造成一系列影响，出于提高试验结果准确性以及动物福利的考虑，应用组织特异性启动子成为趋势。

脂肪组织作为重要的能量存储以及内分泌器官，是研究能量代谢、激素信号通路以及肥胖、糖尿病等疾病的重要位点。最早开发的脂肪组织特异性启动子是成熟脂肪细胞的标记基因—FABP4基因，它是脂肪酸结合蛋白基因家族的成员，主要在脂肪细胞中表达[9]。FABP4基因启动子/增强子元件在物种间保守性很高[10]，小鼠的核心启动子区位于起始密码子ATG上游-168～+21 bp的区域，增强子位于ATG上游-4.9～-5.4 kb的位置[11]，人的启动子/增强子的位置和小鼠是一致的[12]，而猪最高效的启动子在-2.8 kb～+51 bp[13]。应用5.4 kb的FABP4基因全长启动子/增强子制作的转基因小鼠，可实现外源基因仅在生殖腺周围的脂肪与皮下脂肪表达的目的[14]。利用全长启动子/增强子驱动Cre酶的转基因小鼠，与带有loxP位点的转基因小鼠交配，则可以获得在脂肪组织中敲除特定基因的小鼠子代[15]。

脂联素(Adiponectin)基因启动子是最近鉴定的一种脂肪组织特异性启动子，该基因最有效的启动子区域同样位于ATG上游5.4 kb的区域[16]。而PEPCK基因ATG上游-1 242～-828 bp则存在脂肪细胞特异的增强子元件[17]。以上两者同样也是制作脂肪细胞特异转基因动物常用的组织特异性元件。

组织特异启动子必须包含转录启始的核心元件以及特异转录因子的结合位点。经TRANSFAC软件分析[10]，本试验中克隆的FABP4基因启动子/增强子元件经EcoT 22I酶切后的2.3 kb的启动子区，保留了转录核心元件TATA box、CAAT box与增强子元件以及AP-1、TBF-2a、GATA-1等上游启动子元件，并且保留了PPRE、FSE、CEBPα、CEBPδ等脂肪特异转录因子结合位点，本试验证明以上元件可保证外源基因在牛体细胞中的表达。

FABP4基因启动子/增强子元件已在小鼠[18]、大鼠[19]、山羊[20]、人[21]等的细胞中得到功能验证，为检测上述元件在牛的体细胞中的启动效果，本研究选择了牛胎儿成纤维细胞和脂肪间充质干细胞进行比较鉴定，其中胎儿成纤维细胞是常用的核移植供体细胞，脂肪间充质干细胞可定向诱导分化为脂肪细胞。结果显示5.9，2.3 kb的FABP4启动子/增强子均能够驱动目的基因在牛的上述细胞中表达，表明该元件可以用于牛的转基因研究。而且在这2种细胞中2.3 kb片段的转录水平均为5.9 kb的2倍以上，说明2.3 kb片段的启动效率高于5.9 kb片段。但是该启动子在牛其他组织细胞中的启动特异性还有待进一步的试验进行验证。

综上所述，本试验成功克隆了5.9 kb的FABP4基因全长启动子区，并通过酶切去除非核心启动子片段后，保留了2.3 kb的启动子区，通过脂质体转染牛脂肪间充质干细胞和牛胎儿成纤维细胞后，结果转染pMF2.3-Red质粒的细胞红色荧光蛋白mRNA转录水平是pMF5.9-Red的2倍以上，证明小鼠FABP4启动子区可以驱动外源基因在牛的体细胞中表达的同时，经过精简的2.3 kb启动子可将全长启动子的启动效率提高1倍。为下一步制作脂肪特异表达外源基因的转基因牛奠定了基础。

[1] Bertolini L R，Meade H，Lazzarotto C R，et al.The transgenic animal platform for biopharmaceutical production[J].Transgenic Res，2016，25(3)：329-343.

[2] Barlow C，Schroeder M，Lekstrom-Himes J，et al.Targeted expression of Cre recombinase to adipose tissue of transgenic mice directs adipose-specific excision of loxP-flanked gene segments[J].Nucleic Acids Res，1997，25(12)：2543-2545.

[3] Abel E D，Peroni O，Kim J K，et al.Adipose-selective targeting of theGLUT4 gene impairs insulin action in muscle and liver[J].Nature，2001，409(6821)：729-733.

[4] He W，Barak Y，Hevener A，et al.Adipose-specific peroxisome proliferator-activated receptor gamma knockout causes insulin resistance in fat and liver but not in muscle[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(26)：15712-15717.

[5] Imai T，Jiang M，Chambon P，et al.Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes[J].Proc Natl AcadSci U S A，2001，98(1)：224-228.

[6] Zhang X，Xu A，Chung S K，et al.Selective inactivation of c-Jun NH2-terminal kinase in adipose tissue protects against diet-induced obesity and improves insulin sensitivity in both liver and skeletal muscle in mice[J].Diabetes，2011，60(2)：486-495.

[7] Wong K E，Kong J，Zhang W，et al.Targeted expression of human vitamin D receptor in adipocytes decreases energy expenditure and induces obesity in mice[J].J Biol Chem，2011，286(39)：33804-33810.

[8] Kanda H，Tateya S，Tamori Y，et al.MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue，insulin resistance，and hepatic steatosis in obesity[J].J Clin Invest，2006，116(6)：1494-1505.

[9] Storch J，Thumser A E.Tissue-specific functions in the fatty acid-binding protein family[J].J Biol Chem，2010，285(43)：32679-32683.

[10] Shin J，Li B，Davis M E，et al.Comparative analysis of fatty acid-binding protein 4 promoters：conservation of peroxisome proliferator-activated receptor binding sites[J].J Anim Sci，2009，87(12)：3923-3934.

[11] Ross S R，Graves R A，Greenstein A，et al.A fat-specific enhancer is the primary determinant of gene expression for adipocyte P2invivo[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1990，87(24)：9590-9594.

[12] Rival Y，Stennevin A，Puech L，et al.Human adipocyte fatty acid-binding protein (aP2) gene promoter-driven reporter assay discriminates nonlipogenic peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands[J].J Pharmacol Exp Ther，2004，311(2)：467-475.

[13] Jung E M，An B S，Kim Y K，et al.Generation of porcine fibroblasts overexpressing 11beta-HSD1 with adipose tissue-specific aP2 promoter as a porcine model of metabolic syndrome[J].Mol Med Rep，2013，8(3)：751-756.

[14] Jurczak M J，Danos A M，Rehrmann V R，et al.Transgenic overexpression of protein targeting to glycogen markedly increases adipocytic glycogen storage in mice[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2007，292(3)：952-963.

[15] Shi S Y，Luk C T，Brunt J J，et al.Adipocyte-specific deficiency of Janus kinase (JAK) 2 in mice impairs lipolysis and increases body weight，and leads to insulin resistance with ageing[J].Diabetologia，2014，57(5)：1016-1026.

[16] Wang Z V，Deng Y，Wang Q A，et al.Identification and characterization of a promoter cassette conferring adipocyte-specific gene expression[J].Endocrinology，2010，151(6)：2933-2939.

[17] Devine J H，Eubank D W，Clouthier D E，et al.Adipose expression of the phosphoenolpyruvate carboxykinase promoter requires peroxisome proliferator-activated receptor gamma and 9-cis-retinoic acid receptor binding to an adipocyte-specific enhancer in vivo[J].J Biol Chem，1999，274(19)：13604-13612.

[18] Kershaw E E，Morton N M，Dhillon H，et al.Adipocyte-specific glucocorticoid inactivation protects against diet-induced obesity[J].Diabetes，2005，54(4)：1023-1031.

[19] Pravenec M，Kazdova L，Landa V，et al.Transgenic and recombinant resistin impair skeletal muscle glucose metabolism in the spontaneously hypertensive rat[J].J Biol Chem，2003，278(46)：45209-45215.

[20] 陈建文，刘 星，桂 涛，等.fat-1基因脂肪组织特异性表达载体的构建及其山羊转基因细胞系的建立[J].安徽农业大学学报，2012，39(5)：746-750.

[21] Vargas D，Shimokawa N，Kaneko R，et al.Regulation of human subcutaneous adipocyte differentiation by EID1[J].J Mol Endocrinol，2016，56(2)：113-122.

Construction of Red Fluorescent Protein Driven by Mouse FABP 4 Promoter and Expression in Bovine Cells

YUE Yongli，YU Haiquan

(Key Laboratory of Ministry of Education of China for Mammal Reproductive Biology and Biotechnology，Inner Mongolia University，Huhhot 010021，China)

The promoter/enhancer cassette of mouse adipocyte-type fatty acid binding protein(FABP4)was widely used as the adipocyte specific element.To detect the effect ofmFABP4 promoter on gene expression in bovine cells，5.9 kbmFABP4 promoter fragment was cloned from mouse liver genome and identified by digestion and sequencing after ligated to pMD19-T vector.By digestion of enzymeEcoT 22I the non-core promoter fragment was deleted from the 5.9 kb fragment and another 2.3 kb core promoter fragment was obtained.The 5.9 kb and 2.3 kb fragment were inserted into the multiple cloning site of plasmid pDs-Red 2-1 by enzymeSacⅡ，respectively.As a result the vectors，pMF5.9-Red and pMF2.3-Red，were constructed successfully.By lipofection，the constructed pMF5.9-Red and pMF2.3-Red vectors were transfected into bovine adipose-derived stem cells and bovine embryo fibroblast cells，respectively.24 h after transfection，Real-time PCR was applied to detect the transcription of red fluorescent protein in transfected cells.Results showed that the sequence of cloned 5.9 kb fragment was correct，and the 5.9 kb and the 2.3 kb fragments were correctly ligated into vectors.The mRNA of red fluorescent protein was both detected in transfected bovine adipose-derived stem cells and bovine embryo fibroblast cells，and the expression level displayed 2 fold higher in pMF2.3-Red than that of pMF5.9-Red.In conclusion，this study constructed the expression vector pMF5.9-Red and pMF2.3-Red with 5.9 kb or 2.3 kb fragment of mouseFABP4 gene as promoter region could initiate the transcription of foreign genes in bovine cells and the transcription efficiency by 2.3 kb promoter fragment was higher than that of 5.9 kb promoter fragment.

MouseFABP4 promoter；Vector construction；Cattle cells

2016-07-20

转基因生物新品种培育科技重大专项(2014ZX08010005)

岳永莉(1982-)，女，内蒙古呼和浩特人，助理研究员，硕士，主要从事生殖生物学研究。

于海泉(1969-)，男，内蒙古乌海人，研究员，博士，主要从事生殖生物学研究。

Q782

A

1000-7091(2016)06-0026-05

10.7668/hbnxb.2016.06.005