兰州百合鳞茎不定芽诱导和植株再生

胡友军，贾双双，周玉丽

(安徽科技学院 生命科学学院，安徽 凤阳 233100)

兰州百合鳞茎不定芽诱导和植株再生

胡友军，贾双双，周玉丽

(安徽科技学院 生命科学学院，安徽 凤阳 233100)

目的:研究6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和α-萘2酸(NAA)对兰州百合鳞茎的诱导、增殖、生根及试管苗移栽的影响，筛选出不同培养阶段的最佳培养基。方法:选取生长健壮的兰州百合鳞茎，采用MS为基本培养基，添加不同浓度6-BA和NAA，进行不定芽的诱导。以鳞茎诱导的幼苗为外植体，MS添加不同浓度6-BA和NAA进行试管苗增殖培养。将试管苗转入以1/2 MS、MS为基本培养基，添加不同浓度6-BA和NAA组合的生根培养基中进行试管苗的生根培养，当幼根长2～3 cm时，炼苗1～2 d，再移入蛭石和珍珠岩配比为1 ∶1的营养钵中管理。结果:丛生芽诱导时，6-BA的最适浓度为1.0 mg/L，过高则芽的生长受到抑制；增殖试验中，NAA与6-BA配合使用，可提高芽的增殖率，而且新芽产生时间早，增殖倍数高；1/2 MS和MS培养基中NAA可以提高百合幼苗生根率，6-BA则明显抑制生根量。结论:兰州百合鳞茎片不同部位诱导丛生芽的诱导率顺序为下部>中部>上部；经炼苗移栽，再生株成活率可达100%。

百合鳞茎；不定芽诱导；植株再生

兰州百合(Liliumdavidiivar.willmottiae)为百合科百合属川百合的变种，多年生草本植物，为兰州地区名优特产蔬菜之一，其地下鲜鳞茎茎瓣大，阔卵状球形或扁球形，外无皮膜。兰州百合鳞片富含碳水化合物、蛋白质、多种维生素以及人体所必需的多种微量元素，为我国食用百合最佳品种，不仅有极高的营养价值，而且具有滋阴润肺、清心安神、清热利尿、消暑[1]等功效。

兰州百合主要依靠小鳞茎分株繁殖，单鳞片扦插[2]。小鳞茎分株繁殖方式在生产上应用较广，优点在于能保持其后代遗传基础的一致性，较少发生变异。百合长期的无性繁殖会使植株逐渐积累大量病毒，发生病毒病并导致种性退化。种子繁殖虽能获得大量无病毒健康的幼苗，但百合结实率极低，且种子发芽缓慢，栽培周期长，在生产中不适宜大规模采用，难以满足市场需求。为克服传统繁殖方法的不足，加快繁殖速度组织培养方法在国内外都做了不少研究，繁殖的效果也比较好[3-7]。近年来，兰州百合组织培养技术的研究也有报道[8-12]，多以鳞片为外植体，繁殖率高，但鳞片不同部位的繁殖效果存在差异。本试验以兰州百合鳞片为材料，研究不同生长调节剂配比浓度对组织培养的影响，并筛选出最佳培养基配方，为兰州百合组培苗大量生产，提高种球繁殖率、抗病性，实现百合优质种球繁育产业化提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 以兰州百合(农家地方品种)鳞茎为试验材料。主要仪器为电子分析天平(JA2003N型)、移液枪(德国Eppendorf)；药品和试剂为琼脂粉、蔗糖(分析纯)、酒精(分析纯)；α-萘乙酸(NAA，化学纯)、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA，化学纯)。

1.1.2 培养基及培养条件 本试验主要采用MS培养基为基本培养基，生根时使用MS、1/2 MS(大量元素减半)，附加各种激素，每升培养基中加入蔗糖30 g(生根时20 g)，琼脂6 g，调节pH值5.8～6.0，培养温度(25±1)℃，光照1600～2000 lx，14 h/d，相对湿度80%左右[13]。

1.2 方法

1.2.1 外植体的消毒 选取生长健壮的兰州百合鳞茎，剥除外层泥渍较多的老鳞茎片，剪取嫩白肥厚的鳞茎片作为外植体，先用洗涤液或洗衣粉液充分洗涤，再用流动自来水冲洗30 min，置于超净台上用75%酒精消毒30 s，最后用0.1%的升汞溶液消毒15 min，中间更换一次升汞溶液，消毒及冲洗过程中要不断摇动，使药剂充分接触，取出后用无菌水冲洗5～8次，用无菌滤纸吸干表面水分，在无菌的条件下进行接种[14]。

1.2.2 试管苗不定芽的诱导 以MS为基本培养基，6-BA设置0.5、1.0、1.5 mg/L三个浓度梯度，NAA浓度设置为0.1、0.2 mg/L，各组合见表1。每个组合接种9瓶，每瓶接种5片鳞茎片段，且分上、中、基部三个部分接于培养瓶内。

1.2.3 试管苗增殖培养 兰州百合的增殖培养过程中，用鳞茎诱导的幼苗为外植体，以MS为基本培养基，6-BA设置0.2、0.5、0.8 mg/L三个浓度梯度，NAA设置为0.1、0.2、0.3 mg/L三个梯度，各组合见表2。每个组合接种11瓶，每瓶接种4株幼苗。

1.2.4 试管苗的生根培养 试管苗增殖后，选取2～3 cm高,生长健壮的试管苗转入生根培养基中。以1/2 MS(C1～C8)、MS为基本培养基，设置6-BA、NAA两个因素，并且将1/2 MS培养基NAA浓度设置为0.1，0.2，0.3，0.4 mg/L四个浓度梯度，MS培养基NAA浓度设置为0.1，0.2，0.3，0.4 mg/L四个浓度梯度，1/2 MS培养基NAA浓度设置为0.3、0.6、0.9、1.2 mg/L，6-BA浓度设置为0.05、0.1 mg/L两个梯度，各组合见表3。每个组合接种8瓶，每瓶接种4株无菌苗，并定期观察统计生根情况。

1.2.5 试管苗移栽 当幼根在生根培养基上长到2～3 cm左右时，选取生长健壮且生根良好的兰州百合试管苗，去掉培养瓶瓶盖，炼苗1～2 d后将其取出，用自来水洗去其根部的培养基，然后移入以蛭石和珍珠岩配比为1 ∶1的营养钵中。前7 d覆盖无色透明地膜，防止水分蒸发过快，保持温度20～25 ℃左右，湿度80～90%，每1～2 d浇一次清水，中间适当补充1～2次培养液(1/20 MS大量元素)，7 d后逐渐揭去塑料袋，转入常规管理。

另外，分别扦插了一批用100 mg/L的IBA和NAA浸泡5 min的无根苗于以上基质中，浇透水，置于室内散射光下，隔日浇水，并保持一定的湿度，逐渐增加光照量。大约30 d后出苗，放置于室外生长。

1.2.6 数据处理

平均芽数=统计时诱导芽总数/外植体数

诱导率(%)=(统计时萌芽总数/接种芽数)× 100

增殖倍数=统计时芽总数/接种芽数

生根率(%)=(统计时生根的植株数/接种植株数)× 100

平均根数=统计时的总根数/接种植株总数

平均根长=统计时的总根长/接种植株数

2 结果与分析

2.1 不同浓度激素对兰州百合丛生芽的诱导

根据表1的配方，将兰州百合鳞茎消毒的鳞茎片接入MS培养基中，7 d左右鳞茎片开始由白色变成淡黄色，14 d左右鳞茎片转为淡绿色，并有芽形成，3～4周后鳞茎片转为绿色，并随NAA浓度的增高，鳞茎片逐渐转为棕褐色。对40 d的诱导情况进行统计，结果如表1所示。观察发现，虽然A1培养基对鳞茎诱导丛生芽的诱导率不是最高，但其长势情况最好。

表1 不同激素配比对不定芽诱导的影响(40 d)

从表1可以看出，兰州百合上部鳞茎片诱导芽的最适培养基为：MS + 蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L + 6-BA 1.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L，中部鳞茎片诱导芽的最适培养基为：MS + 蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L + 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，下部鳞茎片诱导芽的最适培养基为：MS + 蔗糖30 g/L + 琼脂6 g/L + 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。其中鳞茎片不同部位诱导丛生芽的诱导率顺序为下部>中部>上部。图1(A、B)是培养诱导出丛生芽的生长状况。

2.2 不同浓度激素配比对兰州百合增殖的影响

将兰州百合无菌丛生芽接入A1培养基内进行继代培养一段时间后，转接入不同浓度激素的MS培养基中，培养25 d后对增殖情况进行统计，结果如表2所示。在6-BA浓度为0.2 mg/L，NAA 0.1 mg/L的组合下诱导了大量的丛生芽，增殖倍数达到4.9，可在短期内获得较大的增殖群体，其他处理组出现的丛生芽增值倍数相对较低。

从表2可以看出，不同浓度激素配比对兰州百合增殖效果有着明显的差异，其中B1培养基处理的增殖倍数最大，其次为B4处理。极差分析结果表明，对兰州百合增殖影响最大的因素为6-BA，其次为NAA，其中6-BA以0.2 mg/L效果最好，NAA以0.1 mg/L效果最好，即最优的培养基为：MS + 蔗糖30 g + 琼脂6 g/L+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L。培养增殖芽的生长状况见图1(C、D)。

表2 不同浓度激素配比对增殖的影响(25 d)

注：K1、K2、K3和R为极差分析结果。其中K1、K2、K3分别代表各因素(6-BA和NAA)在水平1、2、3下的增殖倍数之和，R代表各因素处理后增殖倍数最大值与最小值之差。

图1 百合鳞茎不定芽诱导和植株再生各阶段生长状况

A：百合鳞茎诱导14 d左右芽的生长状况；B：百合鳞茎诱导丛生芽40 d的生长状况；C、D：百合试管苗增殖培养25 d的长势；E：百合试管苗生根培养25 d的生长状况；F：试管苗生根移栽30 d的生长状况

A: The growth status of 14 days and so on bulb of lily bulb; B: The growth status of 40 days of induction of cluster buds in lily bulb; C and D: The growth of the test tube plantlets of Lily in 25 days; E: The growth status of the test tube rooting culture of lily bulb for 25 days; F: The growth status of Lily test tube seedlings after rooting for 30 days.

2.3 不同浓度激素对兰州百合生根的影响

6-BA和NAA两种植物激素的不种组合加入1/2 MS(C1～C8)和MS生根培养基中，培养25 d的结果见表3。兰州百合在生根培养基中培养两周后植株开始生根，接种25 d的生根苗见图1(E)。

从表3可以看出，1/2 MS和MS培养基中NAA可以使生根率提高，而6-BA对百合幼苗生根具有明显的抑制作用。由此可见，就根数和根长方面而言C9组合生根培养基中NAA 0.1 mg/L时对生根效果最佳，其中C1～C8培养基内幼苗出现黑根现象，且长势较弱，C5～C8培养基内幼苗生根量较少，C9～C10培养基内幼苗根较为粗壮。综上所述，在本试验中，兰州百合幼苗生根的最佳培养基为：MS + 蔗糖30 g/L + 琼脂6 g/L+NAA 0.1 mg/L。

表3 不同激素浓度对生根的影响(25 d)

2.4 试管苗移栽与扦插

移栽前两周保持较高的空气湿度，移栽后的兰州百合植株能够成活，且长势较好，生根苗在两周左右长出新叶。30 d成活率的统计结果见表4，生根苗移栽见图1(F)。

表4 移栽成活率统计(30 d)

注：D1号处理为生根苗移栽，D2、D3号为无根苗的扦插。

Note: D1 signal processing for rooting plantlets, D2, D3 for cutting seedlings.

由表4可以看出，移栽的生根苗成活率最高为100%，用NAA浸泡的扦插苗比用IBA浸泡的扦插苗成活率高。

3 结论与讨论

3.1 激素种类和浓度对兰州百合鳞茎离体诱导培养的影响

植物组织培养中，应用最多的细胞分裂素为6-BA，6-BA能促进细胞分裂，诱导芽的分化，用量一般在1.0～2.0 mg/L。当组织内细胞分裂素与生长素比例过高时，细胞分裂素起着主导作用，诱导芽的分化，促进侧芽萌发。本次试验选用了添加不同浓度6-BA和NAA的MS和1/2 MS培养基，诱导试验的结果表明，6-BA的最适浓度为1.0 mg/L。随着6-BA的浓度增加，芽的生长反而会受到抑制，甚至导致变态芽的发生，这与宛淑艳等研究结果相接近[15]。故最适培养基为：MS + 蔗糖30 g/L + 琼脂6 g/L + 6-BA1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

3.2 激素种类和浓度对兰州百合幼苗离体增殖培养的影响

不同浓度激素的作用机理不同，在兰州百合丛生芽的增殖试验中使用了6-BA和NAA两类植物激素。NAA与6-BA配合使用，不仅提高芽的增殖率，而且新芽产生时间早、增殖倍数高、种性变异小、成苗率高。

从增殖结果可以看出，幼苗发生的不定芽增殖率与培养基中添加的NAA浓度密切相关，随着NAA浓度的升高，不定芽的增殖倍数增大，NAA浓度为 0.1 mg/L时，增殖倍数达到最大值为4.9，形成丛生芽体，芽苗健壮，长势良好。当NAA浓度高于0.1 mg/L 时，形成丛生芽数量减少。

不同浓度的6-BA 对兰州百合的增殖也有较大影响，浓度较低或较高，增殖效果都不太理想，芽苗较小，长势较弱。当6-BA 浓度为0.5 mg/L时，芽苗增殖倍数最高，且芽苗健壮，叶片颜色鲜绿，长势最好。张卫芳[16]香石竹组织培养的研究也表明在MS + 蔗糖30 g/L + 琼脂6 g/L + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L培养基上，能够保证有一定的增殖倍数。

综上所述，培养基：MS + 蔗糖30 g/L + 琼脂6 g/L + 6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.1 mg/L 最适于兰州百合的增殖培养。

3.3 激素种类和浓度对兰州百合组培苗生根的影响

组织培养中，生长调节剂的种类和浓度的不同组合对器官的形成有着重要作用。本次试验选用了1/2 MS和MS 附加不同浓度的激素对兰州百合鳞茎片组培苗进行生根的培养。从生根结果可以看出，加入适量的NAA可以使生根率明显提高，浓度在0.1 mg/L时最佳，根条数多且长，苗长势较好。所以在兰州百合组培苗生根培养中最佳的培养基为：MS + 蔗糖30 g/L + 琼脂6 g/L + NAA 0.1 mg/L。

3.4 结论

本次试验经过多次重复对比，筛选出不同培养阶段的最佳培养基。在丛生芽诱导培养中，兰州百合上部鳞茎片诱导芽的最适培养基为：MS + 蔗糖30 g/L + 琼脂6 g/L + 6-BA 1.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L；中部鳞茎片诱导芽的最适培养基为：MS + 蔗糖30 g/L + 琼脂6 g/L + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L；下部鳞茎片诱导芽的最适培养基为：MS + 蔗糖30 g/L + 琼脂6 g/L + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L。其中鳞茎片不同部位诱导丛生芽的诱导率顺序为：下部>中部>上部。在增殖培养中，最佳培养基为：MS + 蔗糖30 g/L + 琼脂6 g/L + 6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.1 mg/L。在生根培养中，最佳培养基为：MS + 蔗糖30 g/L + 琼脂6 g/L+NAA 0.1 mg/L。生根苗移栽能够成活且长势良好。30 d的成活率统计显示：生根苗移栽成活率最高达100%。

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(责任编辑：马世堂)

Adventitious Shoots Induction and Plant Regeneration from Bulb Explant ofLiliumdavidiivar.willmottiae

HU You-jun, JIA Shuang-shuang, ZHOU Yu-li

(College of Life Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

Objective:To investigate the effects of 6-BA and NAA on the induction, proliferation, rooting and transplanting of test tube seedlings ofLiliumdavidiivar.willmottiae, and to select the best culture medium in different stages. Methods: Select theLiliumdavidiivar.willmottiaebulb of robust growth, using MS as the basic medium supplemented with different concentrations of 6-BA and NAA for adventitious bud induction. The seedlings were used as explants, MS was added with different concentrations of 6-BA and NAA to test the pro-liferation and culture of test tube seedlings.The plantlets transferred to 1/2 MS and MS as the basic medium supplemented with different concentrations of 6-BA and NAA combination of rooting medium for rooting of plantlets, at the root length of 2～3 cm, 1～2 d seedling, and then into the vermiculite and perlite ratio for the management of nutrition pot in 1 ∶1. Results: Bud induction, the optimum concentration of 6-BA for 1 mg/L, high bud growth was inhibited; proliferation test, with the use of NAA and 6-BA, can enhance the bud proliferation rate and sprout time early, high proliferation rate and MS medium; 1/2 MS in NAA can improve the rooting rate of lily seedlings, 6-BA inhibited the rooting capacity. Conclusion: In different parts ofLiliumdavidiivar.willmottiaebulb slices induced multiple induction rate order lower > middle > upper buds; After transplanting, the survival rate of the regenerated plants was 100%.

Lily bulb; Adventitious bud induction; Plant regeneration

2016-06-01

安徽科技学院校级重点学科(AKZDXK2015C05)。

胡友军(1964-)，男，安徽省定远县人，学士，副教授，主要从事园艺植物栽培生理及组织培养研究。

Q813.1+2

A

1673-8772(2016)06-0026-06