hMSH2和hMSH6蛋白在散发性结直肠癌中的表达及意义

王 静 钟子劭 林益群 邝宇香

hMSH2和hMSH6蛋白在散发性结直肠癌中的表达及意义

王 静 钟子劭 林益群 邝宇香

目的研究广东地区散发性结直肠癌患者hMSH2与hMSH6蛋白表达情况及其与临床特征的关系。方法采用免疫组化法检测了100例广东地区散发性结直肠癌患者的癌组织hMSH 2与hMSH 6蛋白表达情况。结果hMSH2、hMSH6蛋白表达缺失率分别为26.0%和11.0%，两者共同表达缺失率为9.0%；hMSH2蛋白缺失患者与阳性表达患者相比，在年龄、肿瘤部位方面存在显著差异（P＜0.01）；hMSH6蛋白缺失患者与阳性表达患者在性别、肿瘤部位方面存在显著差异（P＜0.05）；hMSH2蛋白和hMSH6蛋白表达呈正相关性（r=0.447，P<0.05）。结论hMSH2与hMSH6蛋白在广东地区散发性大肠癌中有一定比例的缺失，且与肿瘤发生部位、性别、年龄存在相关性，错配修复基因的突变可能参与了肿瘤发生的启动阶段。

散发性结直肠癌；错配修复；hMSH2；hMSH 6

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在我国恶性肿瘤中均排第5位[1]。结直肠肿瘤的发生发展是一个复杂的动态过程，其中涉及许多肿瘤相关因子的参与和调控。除了与癌基因激活和抑癌基因失活有关外，与错配修复系统（m ismatch repair，MMR）亦有密切关系。MMR蛋白在识别损伤信号和引起细胞凋亡的过程中起重要作用，该蛋白缺失会使原癌基因和抑癌基因突变在体内累积，最终可引起细胞增殖、分化的异常，发生恶性肿瘤[2-3]。近年来的研究显示，在结直肠癌组织中有包括hMLH1、hMSH2、hMSH6等多种重要MMR蛋白的缺失[4-6]，但有关散发性结直肠癌（SCC）组织中hMSH2和hMSH6蛋白的表达研究结果却不尽一致。本文通过免疫组化法检测SCC患者结直肠组织中hMSH2与hMSH6蛋白的表达，分析其表达情况与临床病理特征的关系，为进一步阐明错配修复基因在结直肠癌发生、发展过程中的作用提供依据。

资料与方法

一、一般资料

收集2014年1月至2015年1月在广东省中医院住院诊断为结直肠癌并行手术切除，经病理确诊的散发型结直肠癌患者100例，其中男59例（59.0%），女41例（41.0%）；年龄28～89岁，平均年龄63.56岁，中位年龄65岁；高中分化腺癌76例（76.0%），低未分化7例（7.0%），黏液腺癌17例（17.0%）；右半结肠癌（回盲部癌、升结肠癌、结肠肝曲癌及横结肠癌）29例（29%），左半结肠癌（结肠脾曲癌、降结肠癌、乙状结肠癌）35例（35.0%），直肠癌36例（36.0%）；有淋巴结转移60例（60.0%），无淋巴转移40例（40.0%）；Duke分期A和B期共59例（59.0%），C和D期共41例（41.0%）。所有患者术前均未行放化疗，否认肿瘤家族史。30例正常结直肠组织作为对照。排除符合AmsterdamⅡ诊断标准的遗传性非息肉病性结直肠癌。

二、试剂与方法

标本经10%中性缓冲福尔马林固定，常规石蜡包埋，4μm切片。即用型兔抗人MSH2、兔抗人MLH6抗体购自基因科技有限公司，免疫组化过程在罗氏全自动免疫组化仪（Roche Benchmark XT）完成。

三、结果判定

结果判断标准参考许良中等[7]的免疫组织化学反应结果的判断标准，结合染色强度和阳性细胞百分比判定阳性表达程度。hMSH2和hMSH6阳性表达均在细胞核，以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞，光镜下每张切片中选取癌细胞较多的5个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞，按染色强度分级：无着色为0分，淡黄色1分，黄色2分，棕黄色3分；按阳性细胞百分比分级：无阳性细胞为0分；阳性细胞数≤10%为1分；11%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分。两项得分相乘结果≥2分为阳性表达，<2分为阴性表达。用PBS代替一抗作为阴性对照，以正常结直肠黏膜上皮和/或浸润的淋巴细胞为阳性对照，阳性对照核表达阳性而肿瘤细胞核缺乏染色则判为阴性。所有免疫组化染色结果由两名病理科医生复核。

四、统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行处理，计数资料率的比较采用χ2检验、Fisher确切概率法；相关性分析采用Spear-man等级相关检验。P<0.05为差异有统计学意义。

图1 hMSH-2、hMSH-6在癌组织中的表达（×200）

结 果

一、hMSH2和hMSH6蛋白表达情况

结直肠癌组织与正常结直肠组织中hMSH2和hMSH6蛋白主要表达于细胞核及部分细胞质中，间质细胞偶有表达，染色深呈棕褐色（图1）。在100例SCC患者的肠组织中，hMSH2蛋白表达缺失26例，缺失率26.0%，hMSH6蛋白表达缺失11例，缺失率11.0%，hMSH2蛋白和hMSH6蛋白共同表达缺失9例，缺失率9.0%。

二、hMSH2和hMSH6蛋白表达与临床特征的关系

在100例SCC患者中，hMSH2蛋白缺失患者与阳性表达患者相比，在年龄、肿瘤部位存在显著差异（P＜0.01），hMSH2蛋白缺失患者年龄更低，肿瘤发生于右半结肠数量多于左半结肠和直肠，而在性别、肿瘤最大径、浸润深度、分化程度、淋巴转移、Duke分期方面未发现显著差异（P>0.05）。hMSH6蛋白缺失患者与阳性表达患者在性别、肿瘤部位上存在显著差异（P＜0.05），hMSH6蛋白缺失患者男性显著多于女性，肿瘤发生于右半结肠数量多于左半结肠和直肠，而在年龄、肿瘤最大径、浸润深度、分化程度、淋巴转移、Duke分期方面未见显著差异（见表1）。

表1 hMSH-2和hMSH-6蛋白在广东地区散发性大肠癌组织中的表达与临床特征的关系

三、hMSH2和hMSH6蛋白在SCC患者肠组织中表达的相关性

在本研究100例SCC患者的肠组织中，hMSH2蛋白和hMSH6蛋白表达呈正相关性（r= 0.447，P<0.05），见表2。

表2 hMSH2与hMSH6蛋白在散发性大肠癌组织组织中表达的相关性分析

讨 论

近年来的研究发现多种恶性肿瘤，包括结直肠癌、子宫内膜癌等[4-5]的发生与错配修复（M issmatch Repair,MMR）基因的表达缺失有着重要联系。MMR是DNA自我修复系统中的一种方式，主要用于修复碱基的插入、配对及缺失错误，是维持DNA正确复制、遗传的重要机制。MMR基因在原核生物到人类的各种生物中均高度保守，MMR基因通过编码出MMR酶（MMR enzymes,MMREs），结合至错误编码的DNA链上发挥修复错误的作用。目前发现的人类MMR基因主要有与Mut S、Mut L同源的hMLH1、hMSH2、hMSH3、hMSH6等，其中MSH6能与MSH2形成二聚体MutSα，共同起到错配结合的作用。MMR基因缺失多同时伴有微卫星不稳定（MSI），其产生原因是由于错配修复错误导致。若MMR基因表达缺失，不能正确发挥修复错误碱基的作用，会使原癌基因和抑癌基因突变在体内累积，最终可引起细胞增殖、分化的异常，发生恶性肿瘤[2-3]。

在既往MMR与结直肠癌相关的研究中发现，与结直肠癌密切相关的MMR基因主要有hMLH1、hMSH2、hMSH3、hMSH6等[4-5]。大多数MMR缺失的结直肠癌患者属于遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC），大约占76%，而仅有约8.8%～20.4%与散发性结直肠癌（SCC）有关，且均存在高度微卫星不稳定（High MSI,MSI-H），并与MHL-1启动子甲基化密切相关[4,8-10]。

本研究对广东地区散发性结直肠癌患者病理组织hMSH2、hMSH6表达情况及其与临床病理特征的关系进行了研究，结果表明hMSH2缺失率为26.0%，hMSH6缺失率为11.0%，略高于其他地区的研究结果。在与临床特征的关系方面，hMSH2与hMSH6蛋白表达缺失率在右半结肠显著高于左半结肠和直肠，这与国内外的研究基本相符合[11-13]，提示MMR蛋白缺失更容易导致右半结肠癌的发生，其原因与右半结肠癌发生阶段可能存在更高比例的基因启动子甲基化、病理组织学特征倾向于MSI-H表达及右半结肠与左半结肠、直肠生物学和分子学特征不同有关[11]，MMR蛋白表达可能更多地参与肿瘤发生的早期阶段。

此外，Kmschewski等[14]在研究SCC时发现MSH2蛋白表达缺失与肿瘤的分化程度、Duke分期和淋巴结转移无关。但也有研究显示异常的MMR蛋白的表达与患者的年龄、性别或种族群体之间没有任何的关联，而与肿瘤部位、肿瘤类型及肿瘤分化程度相关[15]。本研究中hMSH2蛋白表达在年龄分布上存在显著差异，年龄＜60岁组的hMSH2蛋白缺失率高于≥60岁组，提示hMSH2蛋白缺失者结肠癌的发病年龄更早。而hMSH6蛋白表达缺失者中，男性比女性更多。在本研究中，hMSH6和hMSH2在肿瘤最大径、浸润深度、分化程度、淋巴转移、Duke分期间未见显著差异，与一些国外文献报道相符[14]，这提示错配修复基因的突变可能只作用于肿瘤的启动发生阶段，与其浸润和转移的关系不大。本研究结果可能与标本的数量、标记方法及结果的判定标准选择不同等因素有关，还需扩大样本量深入研究来证实dMM R检测的应用意义，为大肠癌的诊治提供依据。

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The expression and significance of protein hMSH2 and hMSH6 in sporadic colorectal carcinoma

WANG Jing，ZHONG Zi-shao,LIN Yi-qun,KUANG Yu-xiang.The 2ndAffiliated Hospital,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhuo 510504

ObjectiveTo investigate the relationship between clinical characteristics and hMSH2, hMSH6 protein expression of patients w ith sporadic colorectal carcinoma(SCC)in Guangdong province.MethodshMSH2 and hMSH6 expressionwere detected by immunohistochemistry in 100 casesof SCC specimenscollected from Guangdong province.ResultsTheexpression loss rateof hMSH2 and hMSH6was26.0% and 11.0%respectively,and common loss ratewas9.0%.Compared w ith hMSH2 positive patients,the age and tumor location of hMSH2 negative patientswere significantly different(P＜0.01).Compared with hMSH6 positive patients,the gender and tumor location of hMSH6 negative patientsw ere significantly different(P＜0.05).Therewasa positive correlation between the expression of hMSH2 and hMSH6 proteins in SCC(r= 0.447,P<0.05).ConclusionsLossexpression of hMSH2 and hMSH6 proteinswasproportionally observed in patientsw ith SCC in Guangdong province,w hich could correlatew ith age,gender,and tumor location.Mutation ofm ismatch repairgenemightoccur in initiating stageof SCC.

Sporadic colorectal carcinoma;Mismatch repair;hMSH2;hMSH6

2016-07-14）

（本文编辑：白杨）

10.3969/j.issn.1672-2159.2016.05.003

510504广州中医药大学第二附属医院

王静，Email：drwangjingxj@163.com

广东省科技计划项目（2012B031800202）