诱导性多能干细胞在心肌病中的应用

李萌萌综述，周建业、宋江平审校

综述

诱导性多能干细胞在心肌病中的应用

李萌萌综述，周建业、宋江平审校

诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）的研究促进了再生医学的发展。在外源因子作用下，分化成熟的细胞通过诱导去分化变为具有分化潜能的多能干细胞，后者亦可再分化为其他细胞。心肌病是心血管疾病中一类常见疾病，终末期可进展为心力衰竭，是目前世界范围内主要致死因素之一。本文对iPSC在心肌病临床和基础研究中的应用作一综述。

综述； 心肌病；干细胞

2006年,日本科学家Yamanaka等首次将胚胎干细胞（ESC）富含的4个重要转录因子Oct4, Sox2, Klf4和 c-Myc（Yamanaka 因子） 通过逆转录病毒转染到小鼠胚胎成纤维细胞中，成功诱导出一种具有分化潜能的细胞,因此命名为诱导性多能干细胞（iPSC）[1]。随着iPSC技术的推广,从肝脏细胞，神经元细胞，角质细胞中成功诱导出iPSC[2]。心肌病是一类复杂疾病，终末期可以进展为心脏衰竭，其具体分子机制尚不明确[3]。心肌病分子机制研究的一大瓶颈是建立体外细胞模型及获取人源心肌组织，而动物模型又不能完全模拟人体的疾病状态。通过将患者iPSC分化为心肌细胞，携带有患者全部遗传信息，并在体外建立其相应心肌病的细胞模型甚至心肌微组织，可以用于心肌病发病机制研究并作为药物筛选的细胞平台[4]。同时iPSC来源于自体细胞，在增殖分化潜能上有胚胎干细胞的特性，且获取较为容易，也避免了直接研究胚胎干细胞带来的伦理学问题[5]。在分化效率上，iPSC明显优于间充质干细胞[6]。将iPSC诱导分化为心肌细胞，这对心肌病致病机制的研究，寻找相应的信号通路以及致病靶点都起到至关重要的作用，极大地促进了心肌病基础研究发展[7]。本文将重点讨论iPSC在心肌病致病机制研究中的应用以及临床治疗。

1 iPSC与心肌病基础研究

心肌病是我国乃至全世界人群中重要的致死因素之一[8]。如限制型心肌病在年轻人中的发病率为1/500, 扩张型心肌病每10万人群中有40～50人患有该病[9]。心肌病主要分为原发性心肌病和获得性心肌病，前者主要包括扩张型心肌病、致心律失常性右心室心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病等，其中有相当一部分与遗传突变相关；而后者有炎症性心肌病[3]。此外，还有冠心病、瓣膜病等并发缺血性心肌病、瓣膜性心肌病等。

1.1 iPSC与扩张型心肌病

扩张型心肌病主要临床特征为左心室扩张，收缩功能障碍，并最终导致心力衰竭，在成人中的发病率约为1/2500[10]。最近研究发现，肌小节蛋白（Titin, TTN）的截短突变是导致扩张型心肌病的重要原因，18%的散发性扩张型心肌病和25%的家族性扩张型心肌病是由TTN基因突变引起的[11]。Hinson等[12]通过提取扩张型心肌病患者的外周血样本单核细胞，在体外加入Yamanaka因子诱导得到iPSC；同时提取正常人外周血单核细胞诱导得到iPSC，并利用Crispa-Cas9技术定点进行TTNtvs截短突变，通过病毒载体导入，利用Cas9作为核酸内切酶在sgRNA （short guide RNA） 引导下在DNA分子中进行剪切。将两种来源的iPSC诱导分化形成心肌细胞并构建心脏微组织。通过对其组织收缩力等心肌表型进行检测，发现含有截短突变的心脏微组织收缩力明显下降，心肌组织肌小节分布紊乱。对携带突变的心脏微组织进行牵拉刺激和异丙肾上腺素刺激，与对照组相比，突变组的收缩力也明显下降，表明TTN突变导致异常的心肌应激反应。转录组学分析发现，突变型细胞中血管内皮生长因子（VEGF）、纤维母细胞生长因子（FGF ）、上表皮生长因素（EGF）等生长因子表达下调，miR-1、miR-16和miR-124表达上调。研究表明TTN截短突变是导致扩张型心肌病发生的原因，其可能通过降低部分生长因子表达水平，及心肌相关miRNA上调导致疾病的发生。在体外构建携带致病突变的iPSC，使得能够在细胞水平检测相关因子的变化，为阐述该致病机制提供参考。

1.2 iPSC与致心律失常性右心室心肌病

致心律失常性右心室心肌病是一种桥粒蛋白突变相关的遗传性疾病，其特征主要表现在右心室局灶性纤维脂肪替代及心肌细胞缺失并伴有室性心率失常，是导致青年人及运动员猝死的重要原因之一[13]。超过50%患者携带桥粒蛋白基因的突变，最普遍的就是plakophilin-2 （PKP2）基因突变[14]。该病致病机制尚未阐明，主要原因有以下三方面：（1）由于致心律失常性右心室心肌病是慢性进展性疾病，因此从早期获得该病的心脏样本几乎是无法实现的；（2）对该病患者进行心脏组织活检有心脏穿孔的风险，极大地限制了心肌样本的获取；（3）该病动物模型病理特征与人有较大差异，其中最为显著的是极少有脂肪浸润[15]。iPSC技术很好地解决了这些难题，Kim等[16]将致心律失常性右心室心肌病患者（携带有桥粒基因PKP2致病突变）的成纤维细胞重编程为心肌细胞。研究发现，诱导分化的心肌细胞表面桥粒基因表达下调，但并没有出现明显的脂肪形成或细胞凋亡。为了诱导其产生类似于人体的致心律失常性右心室心肌病特征性病理表型，研究者在心肌细胞中加入3F因子（包括胰岛素，地塞米松，异丁甲基黄嘌呤），观察到不显著的脂肪形成和微弱的细胞凋亡；尝试加入5F因子（包括胰岛素，地塞米松，异丁甲基黄嘌呤，罗格列酮，吲哚美辛）后，发现心肌细胞出现明显的脂肪形成和细胞凋亡。分析显示PPAR-γ表达上调并检测到其在核内异常的印记。因此推测PPAR-γ在形成致心律失常性右心室心肌病病理表型中发挥重要的作用。研究者进一步实验证实加入PPAR-γ激动剂可致心肌细胞在体外发生显著脂肪形成和细胞凋亡，从而揭示了PKP2突变导致致心律失常性右心室心肌病的致病机制。体外构建的基于患者遗传背景的iPSC模型能够模拟致心律失常性右心室心肌病病理特征，并通过功能学研究探索出相关致病机制。

1.3 iPSC与肥厚型心肌病

肥厚型心肌病显著病理特征是不明原因的左心室肥大，舒张期功能障碍，间质纤维性增加，肌纤维紊乱，同样可以导致心源性猝死或终末期心力衰竭[17]。肥厚型心肌病患者致病基因的发现加深了对于致病机理认识[18]，但是肥厚型心肌病如何在不同基因突变下产生表型仍然未知[19]。Tanaka等[20]利用患者来源的iPSC诱导得到心肌细胞，致力于发现导致肥厚型心肌病表型的共同通路。与不携带致病突变的野生型相比，携带突变的心肌细胞并未表现出明显病理形态学特征型。然而内皮素-1 （ET-1） 能加速心肌肥大，导致细胞纤维紊乱。进一步研究揭示ET-1主要促进活化T细胞核因子（NFAT）在核内集聚从而促进形成肥厚型心肌病表型。该项研究结果表明患者遗传背景、环境因素以及ET-1共同促进重编程心肌细胞产生肥厚型心肌病表型，这对于解析致病机制以及基因突变所致下游调控网络提供了重要的理论支持。

1.4 iPSC应用于心肌病基础研究的局限性

然而，需要指出的是iPSC诱导效率较低，鼠的iPSC诱导效率约为0.1%，而人iPSC诱导效率仅在0.01%左右，目前通过修改转录因子，加入microRNAs，小分子物质等可将iPSC的诱导效率提高2～5倍[21]。但是iPSC诱导效率低仍是制约iPSC技术应用于基础研究的一大瓶颈。另一方面iPSC诱导分化所得到的心肌细胞通常在形态及生理功能方面都表现为胚胎期细胞未成熟状态而不是成熟心肌细胞表型[22]。因此由于结构和功能上与成熟心肌细胞之间的差异，在体外以iPSC诱导得到心肌细胞作为疾病模型的可靠性有待考究[16]。

2 iPSC与心肌病临床研究

iPSC技术极大地促进了疾病诊断及再生医学的发展[23]，同时为心肌病的治疗提供了新的视野，并能在个体疾病水平上进行研究。Ye等[24]以患有心肌梗死的猪为模型，移植人源性iPSC诱导分化的心肌细胞，研究结果表明，注射在心肌梗死与正常组织交界区的人源性iPSC诱导分化的心肌细胞产生完整的肌节结构，并行使相应的功能。细胞移植显著减小了心肌梗死区面积，减轻了心室壁的压力，并且增强了心肌代谢，改善了左心室功能。Zhang等[25]利用人源性心肌成纤维细胞制备iPSC并诱导分化为心肌细胞，且将后者移植到小鼠心肌梗死交界区。在4周后，细胞凋亡减少，左心室收缩力明显增强，心肌梗死症状明显减轻。这些研究提示，人源性iPSC有希望于参与心脏损伤后的心肌修复。Shiba等[26]利用猴源成纤维细胞制备iPSC并诱导分化为心肌细胞，该心肌细胞为HT4单体型，将其移植到HT4杂合型猴子心肌梗死交界区。在12周内，未见到明显的免疫排斥，且在移植后4～12周，心脏收缩功能明显改善。

来自患者iPSC作为重要的心肌病药物筛选模型在肥厚型心肌病、扩张型心肌病等心肌病治疗药物的筛选取得了重大进展[27]。研究表明， iPSC源性的心肌细胞模型在心肌病药物研究中的重要作用并为进一步的临床试验提供数据支持。

尽管iPSC对于再生医学的发展具有重大意义，但是这项技术应用于临床治疗还有很多问题需要解决，如诱导效率低下，满足不了临床治疗的细胞数量。研究表明，将iPSC源性心肌细胞在未纯化的状态下移植到小鼠心肌梗死的交界区，在一周后左心室出现团块，随后该团块增长，免疫组化分析该团块为畸胎瘤[28]。这在很大程度上限制了这项技术在临床上的应用。此外，移植的iPSC源性心肌细胞与自体的心肌细胞整合程度不高，移植后的动物易出现心律失常[26]。因此，安全性问题也同样掣肘iPSC应用于临床。

3 展望

iPSC技术为在体外研究疾病的分子病理机制提供了独特的方法。在过去几年，iPSC已应用于多种心肌病的研究，构建了多种心肌病体外iPSC模型，从而进行遗传变异与疾病表型相互作用的分析，获得对于心肌病的新见解。将iPSC技术与基因编辑，全基因组技术等相结合是未来的发展方向，将使得iPSC成为生物医学研究一个必不可少的工具。

目前iPSC技术在人心肌病治疗中还未应用于临床。对心肌病的治疗可能主要集中在两方面：一方面，减轻心肌损伤和左心室的扩张；另一方面，改善慢性心力衰竭患者心脏收缩能力。iPSC被认为是生物医学领域的重要资源，可作为研究疾病致病机制的细胞模型，并进一步提供突变导致患者产生特殊疾病表型的功能验证，以及评估疾病治疗效果并为个体化医疗提供依据[29,30]。因此，iPSC技术对心肌病基础研究与临床治疗都具有深远意义。尽管iPSC应用仍存在限制，然而iPSC在基因水平上为心肌病研究提供了个体化治疗的事实依据。

随着iPSC在疾病模型，药物筛选，细胞治疗等研究方面的快速发展与应用，iPSC将提供导致疾病发生的更全面的基础与临床信息。在不久的将来，iPSC将更进一步地参与心肌病的转化医学应用。

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2016-11-21）

(编辑:汪碧蓉)

CIFMS （2016-I2M-1-015）；国家自然科学基金 （NO 81670376）；PUMC青年基金；中央高校基本科研业务费基金

100037 北京市，北京协和医学院 中国医学科学院 国家心血管病中心 阜外医院 心血管疾病国家重点实验室 心血管外科

李萌萌 硕士研究生 主要从事心肌病研究 Email:fw_lmm@163.com 通讯作者：宋江平 Email:fwsongjiangping@126.com

R541

A

1000-3614（2017）09-0934-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.09.026