多重PCR对禽分枝杆菌亚种鉴定的初步应用

张 阁，彭 永，刘国权，蒋 卉，冯 宇，朱良全*，丁家波*

(1.中国兽医药品监察，北京 100081；2.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.10.02

多重PCR对禽分枝杆菌亚种鉴定的初步应用

张 阁1，彭 永1，刘国权1，蒋 卉1，冯 宇2，朱良全1*，丁家波1*

(1.中国兽医药品监察，北京 100081；2.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018)

为建立禽分枝杆菌多重PCR鉴定方法，根据国外报道的诊断方法设计4对特异性引物，选用我国禽结核参考菌株(CVCC 68201)基因组DNA为模板，优化了退火温度，测定了DNA最小检测量，并进行了特异性检验。采用优化好的多重PCR体系，对国家兽医微生物菌种保藏中心保存的禽分枝杆菌标准菌株进行检测和分类。实验结果表明，禽结核参考菌株(CVCC 68201)能很好的扩增出577 bp(IS901基因片段)、385 bp(IS1245基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)三条目的条带，基因组DNA的最小检测量为0.38 ng/μL，目的条带在退火温度50 ℃～62 ℃之间均能得到有效扩增。对23株禽分枝杆菌菌株检测，并设立牛分枝杆菌作为阴性对照，最终将禽分枝杆菌菌株分为三大类：禽亚种/森林土壤亚种、副结核亚种、人猪亚种，与国家兽医微生物菌种保藏中心的分类结果相比不仅一致且更加详尽而有临床意义。因此，基于分子生物学方法建立的多重PCR方法可以对禽分枝杆菌亚型进行快速鉴定并对禽结核病的诊断提供参考。

禽分枝杆菌；亚型鉴定；多重PCR

禽分枝杆菌(Mycobacteriumavium)是一种环境分枝杆菌，在自然界中普遍存在，可从自然来源的水、土壤、植物、垫料中分离得到[1-2]。禽分枝杆菌能够感染多种禽群，引起以肠道、肝脏和脾脏结核性结节为特征的病变，也可以感染人、猪、牛、羊等动物[3-5]。禽分枝杆菌具体可分为4个亚种，即引起禽结核病的禽分枝杆菌禽亚种(M.aviumsubsp.avium,MAA)；从环境、人及猪分离出的禽分枝杆菌人猪型亚种(M.aviumsubsp.hominissuis,MAH)；引起牛羊等反刍动物副结核病的禽分枝杆菌副结核亚种(M.aviumsubsp.paratuberculosis,MAP)；可导致林鸽禽结核病的禽分枝杆菌森林土壤亚种(M.aviumsubsp.silvaticum,MAS)[6-7]。准确的亚种鉴定对禽结核病的诊断和防控具有重要意义，传统的血清学分型方法不仅耗时、存在安全隐患，而且只能简单的将禽分枝杆菌复合体(M.aviumcomplex,MAC)分为禽分枝杆菌和胞内分枝杆菌两大类[5]。许多基于分子生物学的方法可用于禽分枝杆菌种型的鉴定，目前常用的禽分枝杆菌分型方法主要包括：16S rRNA测序法[8]、16S-23S rRNA间隔区测序法[9]、限制性片段长度多态性分析法(RFLP)[10]等，但都存在耗时、判读结果繁琐等缺点。随着研究的深入，研究人员发现dnaJ基因是禽分枝杆菌4个亚种中均含有的片段，IS900基因是禽分枝杆菌副结核亚种(MAP)特有的片段，通过检测IS901基因、IS1245基因和dnaJ基因可确定禽分枝杆菌禽亚种(MAA)/禽分枝杆菌森林土壤亚种(MAS)的存在，通过检测IS1245基因和dnaJ基因可确定禽分枝杆菌人猪亚种(MAH)的存在[11-12]。2008年，Moravkova等[13]建立了多重PCR方法并用于禽分枝杆菌亚型鉴定的研究。鉴于该方法在我国尚未有相关报道，为了加快推进我国禽分枝杆菌流行病学研究并为禽结核病快速诊断奠定基础，本实验结合国外最新的多重PCR方法对中国兽医微生物菌种保藏管理中心保存的禽分枝杆菌进行了检测。

1 材料与方法

1.1 菌种及来源 试验中涉及到的28个标准菌株均来自国家兽医微生物菌种保藏中心，见表1。

1.2 试剂、培养基和引物 细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；一般PCR用Premix Taq购自宝生物工程(大连)有限公司；佩氏培养基(Petragnani medium)按照《兽用生物制品规程》(2000年版)制备[15]。按照表2所示序列[13]，设计的PCR引物由中美泰和生物公司合成。

1.3 菌种复苏、繁殖及基因组提取 无菌开启购自国家兽医微生物菌种保藏中心各冻干菌株，分别使用1 mL灭菌生理盐水将菌种溶解，接种到预先制备好的佩氏培养基斜面。置37 ℃培养2～4周，经肉眼观察长出干燥颗粒状乳酪色菌落后，用生理盐水洗下用于提取基因组DNA。

1.4 禽分枝杆菌各亚种的多重PCR 建立

1.4.1 退火温度的优化 以提取的禽结核分枝杆菌参考菌株(CVCC 68201)全基因组DNA为模板，以参考文献[13]设计的dnaJ、IS900、IS1245和IS901的4对引物进行扩增，将退火温度设计成不同温度梯度。反应体系为20 μL：基因组1 μL，dnaJ引物(20 pmol/μL)、IS1245引物(10 pmol/μL)、IS900(10 pmol/μL)和IS901(10 pmol/μL)的上下游引物各1 μL，2×PCR反应液Premix Taq 10 μL，灭菌双蒸水1 μL。反应程序：第一步，96 ℃ 2 min；第二步，96 ℃ 10 s，50 ℃(52 ℃、54 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃和62 ℃) 10 s，72 ℃ 1 min，35个循环；第三步，72 ℃ 2 min。PCR反应结束后，取10 μL产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像分析系统上观察结果。

1.4.2 多重PCR灵敏度(基因组DNA最小检测量)的确定 将1.4.1项提取的禽结核分枝杆菌参考菌株(CVCC 68201)基因组DNA测定浓度后，用双蒸水梯度稀释成1.5、0.75、0.38、0.19、0.09和0.05 ng/μL，用1.4.1优化的多重PCR进行检测和电泳，确定其对基因组DNA的最小检测量。

1.4.3 多重PCR特异性检测

1.4.3.1 禽分枝杆菌各亚种代表性菌株基因组DNA提取 提取禽分枝杆菌各亚种代表菌株CVCC 68201(禽亚种/森林土壤亚种)、CVCC 323(副结核亚种)、CVCC 280(人猪亚种)的基因组DNA，并选择牛分枝杆菌标准菌株CVCC 68001、CVCC 68002、CVCC 291的基因组DNA作为对照，运用1.4.1优化的多重PCR反应体系检测和电泳，确定特异性检测结果。

1.4.3.2 禽分枝杆菌各亚种的多重PCR判定标准

多重PCR检测的扩增条带呈现577 bp(IS901基因片段)、385 bp(IS1245基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)三条目的条带，则判为禽分枝杆菌禽亚种/禽分枝杆菌森林土壤亚种; 多重PCR检测的扩增条带呈现385 bp(IS1245基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)两条目的条带，则判为禽分枝杆菌人猪亚种；多重PCR检测的扩增条带呈现215 bp(IS900基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)两条目的条带，则判为禽分枝杆菌副结核亚种。

1.5 多重PCR对禽分枝杆菌菌种的鉴定 提取国家兽医微生物菌种保藏中心保存的23株禽分枝杆菌基因组DNA，运用1.4.1优化的多重PCR反应体系检测和电泳，并根据1.4.3.2判定标准进行分类，判定与菌种目录[14]收载结果的一致性。

2 结 果

2.1 多重PCR体系退火温度确定 由图1可知，当退火温度设定为50 ℃～62 ℃时，利用多重PCR检测体系均能有效扩增出目的基因，但以56 ℃～60 ℃的退火温度最佳。

2.2 多重PCR灵敏度(最小检测量)结果 由图2可知，随着反应体系中模板浓度的降低，多重PCR的最低检测限度为0.38 ng/μL。

2.3 多重PCR特异性测定结果 由图3看出，牛分枝杆菌仅能扩增出140 bp条带，禽分枝杆菌各亚种代表菌株均能扩增出140 bp条带，禽亚种/森林土壤亚种扩增出140 bp、385 bp、577 bp条带，副结核亚种扩增出140 bp、215 bp条带，人猪亚种扩增出140 bp、385 bp条带。

2.4 23株标准菌株的多重PCR扩增结果 由图4看出，所涉及的23株禽分枝杆菌，菌株CVCC 281、CVCC 283、CVCC 284、CVCC 280、CVCC 282为人猪亚种，可扩增出140 bp、385 bp条带；菌株CVCC 1646和CVCC 1625为副结核亚种，可扩增出140 bp、215 bp条带；其他菌株均为禽亚种/森林土壤亚种，可扩增出140 bp、385 bp、577 bp条带。该结果与菌种目录[14]中收载结果一致。

3 讨 论

多重PCR因其快速、灵敏度高等特点尤其适用于禽分枝杆菌这种具有一定生物安全风险的病原鉴定。本实验结合国外最新研究进展[13]和国内23株禽分枝杆菌标准菌株在此方面开展研究，对多重PCR特异性进行了验证并确认了最低核酸检测限度0.38 ng/μL。在实验过程中，多重PCR体系采用常规PCR商品化Premix Taq，既实现了目的条带有效扩增又有效避免了dNTP浓度、Mg2+浓度等因素的影响。多重PCR技术对退火温度要求很高[16]，考虑到实验室及PCR仪不同可能会导致退火温度的差异，从而对多重PCR结果产生影响，本试验共设计了7个梯度的退火温度(50～62 ℃)，均能扩增出特异性目的条带(以56～60 ℃为最佳)，表明该技术具有推广价值。

根据多重PCR产物条带情况可以将禽分枝杆菌复合体细分为符合致病性和宿主特点的亚种：禽亚种/森林土壤亚种(140 bp+385 bp+577 bp)、副结核亚种(140 bp+215 bp)、人猪亚种(140 bp+385 bp)。通过多重PCR方法还将同为血清3型的菌株CVCC 277与菌株CVCC 280进一步细分为菌株CVCC 277(禽亚种/森林土壤亚种)与菌株CVCC 280(人猪亚种)，一定程度上弥补了传统血清学分型方法的不足。

该多重PCR方法尚不能区分鸟亚种与森林土壤亚种。因为两者基因组DNA序列极其相似，即使16S rRNA测序等方法也无法区分鸟亚种与森林土壤亚种。也正因为如此，Turenne等[17]认为森林土壤亚种就是禽亚种。人们目前只能根据原代培养森林土壤亚种时要添加草分枝菌素等培养特性来实现禽亚种与森林土壤亚种的鉴别[6]。

鉴于本实验中所用的菌株均为参考菌株，下一步工作仍需收集野外分离株进行验证。另外，该多重PCR方法不能区分禽亚种与森林土壤亚种，将有待进一步研究。

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UseofMultiplexPCRAssayfortheIdentificationofMycobacteriumaviumSub-species

ZHANG Ge1, PENG Yong1, LIU Guo-quan1, JIANG Hui1, FENG Yu2, ZHU Liang-quan1*, DING Jia-bo1*

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China; 2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShandongAgricultureUniversity,Tai'an,Shandong271018,China)

ZHULiang-quan,E-mail:zhuliangquan9990@hotmail.com;DINGJia-bo,E-mail:dingjiabo@126.com

In order to establish a multiplex PCR method forMycobacteriumavium(M.avium), four specific primers were designed according to the diagnostic methods reported in foreign countries. The genomic DNA of bovine tuberculosis reference strain (CVCC 68201) was selected as the template, the minimum detection amount of DNA was determined, the annealing temperature was optimized and the specificity was tested. TheMycobacteriumaviumstandard strains preserved by the China Veterinary Culture Collection Center (CVCC) were tested and classified by the optimized multiplex PCR system. The results showed that the reference strain (CVCC 68201) could amplify bands of 577 bp (IS901 gene fragment), 385 bp (IS1245 gene fragment) and 140 bp (dnaJ gene fragment), and the minimum detectable amount of genomic DNA is 0.38 ng/μL, the purpose bands can be effectively amplified between the annealing temperature of 50 ℃～62 ℃. Twenty-three strains ofMycobacteriumaviumwere detected and theMycobacteriumboviswas used as negative control. TheMycobacteriumaviumisolates were divided into three categories:M.aviumsubsp.avium/M.aviumsubsp.silvaticum,M.aviumsubsp.hominissuis,M.aviumsubsp.paratuberculosis. Compared with the classification results of China Veterinary Culture Collection Center, our results are not only consistent but also more detailed and of clinical significance. Therefore, the multiplex PCR method based on molecular biology method can rapidly identify the subtype ofMycobacteriumaviumand provide reference for the diagnosis of avium tuberculosis.

Mycobacteriumavium; subtype identification; multiplex PCR

2017-04-05

A

1002-1280 (2017) 10-0011-07

S852.6

国家重点研发计划(2016YFD0500902)

张 阁，硕士研究生，从事人畜共患传染病研究。

朱良全，E-mail：zhuliangquan9990@hotmail.com；丁家波，E-mail：dingjiabo@126.com

(编辑：李文平)