辣蓼黄酮中芦丁、槲皮素与槲皮苷的含量分析

谷俐媛，陶俊宇，曾 芸，韦英益，胡庭俊*

(1广西大学动物科学技术学院，南宁530005；2广西医科大学基础医学院，南宁530021)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.10.06

辣蓼黄酮中芦丁、槲皮素与槲皮苷的含量分析

谷俐媛1，陶俊宇2，曾 芸1，韦英益1，胡庭俊1*

(1广西大学动物科学技术学院，南宁530005；2广西医科大学基础医学院，南宁530021)

为保障辣蓼黄酮工业化生产中的质量控制，建立辣蓼黄酮中芦丁、槲皮素与槲皮苷含量测定高效液相色谱法。结果表明，运用高效液相色谱法测定辣蓼黄酮乙酸乙酯部分(FEA)中芦丁、槲皮苷与槲皮素的含量分别为281.97、160.98、83.31 mg/g，辣蓼黄酮正丁醇部分(FNB)中芦丁、槲皮苷与槲皮素的含量分别为150.33、147.51、73.82 mg/g。该方法简单、准确、灵敏、重复性好，可作为辣蓼黄酮中芦丁、槲皮素与槲皮苷含量分析的参考方法。

辣蓼；黄酮；高效液相色谱；含量分析

辣蓼，味辛、温，具有祛风利湿，散瘀止痛，解毒消肿，杀虫止痒之功效[1]。张国英等采用聚酰胺柱层析的方法，从辣蓼中分离得到5个黄酮类化合物：金丝桃苷、芦丁、槲皮素、异鼠李素、山奈酚[2]。现代科学研究表明，黄酮类化合物具有生物抗氧化性、清除自由基作用以及抗衰老的活性，能影响血管的脆性与通透性、改善血液循环状态，净化血液，有降血脂、降血压、降血糖的作用，还有镇痛、免疫、抗炎、抗菌等药用保健功能[3]。

目前，用于黄酮类化合物检测的方法包括分光光度法、薄层色谱法、超临界流体色谱法、质谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳法[4-9]。其中，分光光度法操作简单，但误差较大。质谱及其联用技术所用仪器精密，但价格非常昂贵。薄层色谱法和毛细管电泳法在灵敏度和精确度方面都不如高效液相色谱法。因此，本研究选用进样量少，分辨效率高、灵敏度和准确度高的高效液相色谱法作为测定辣蓼黄酮中芦丁、槲皮素与槲皮苷含量的分析方法。高效液相色谱法(HPLC)应用广泛，已成为生命科学，临床化学，药物研究等方面的重要检测方法[10]。HPLC法具有分离效能高，灵敏度高，重现性好的优点[11]。本试验运用高效液相色谱法，以芦丁、槲皮素与槲皮苷为对照品对辣蓼总黄酮进行目标成分含量测定，为获得质量稳定含量均一的辣蓼总黄酮提供方法依据。

1 材 料

1.1 仪器与试剂 Waters 2695分离单元，Waters2998二极管阵列检测器，Empower色谱工作站，超声波清洗机(DTDN，宁波新芝生物科技有限公司)，纯水仪(CD-UPT-1，成都纯越科技有限公司)，微量离心机(TYPE1-14，SIGMA)，旋转蒸发仪(ALPHA RA-8，Heidolph)，电热恒温干燥箱(DHG-9071A，上海精宏实验设备有限公司)，乙腈(色谱纯，TEDIA)，磷酸(色谱纯，Fisher)，甲醇(色谱纯，TEDIA)，石油醚(分析纯，西陇化工股份有限公司)，三氯甲烷(分析纯，西陇化工股份有限公司)，无水乙醇(分析纯，北京化工厂)，芦丁对照品(中国食品药品检定研究院 100080-200707)，槲皮素对照品(中国食品药品检定研究院 100081-201408)，槲皮苷对照品(中国食品药品检定研究院 111538-200504)。

1.2 辣蓼黄酮 辣蓼生药购自南宁市山草堂，经酶解-超声偶联法提取后滤液经过石油醚、氯仿、乙酸乙酯以及正丁醇萃取。收集乙酸乙酯与部分与正丁醇部分，经XDA-8大孔吸附树脂分离纯化，得辣蓼黄酮乙酸乙酯部分(FEA)与辣蓼黄酮正丁醇部分(FNB)。FEA为淡黄色粉末，FNB为棕黄色粉末。

2 方 法

2.1 色谱条件 色谱柱为Waters XBridgeTM C18 (4.6 mm×250 mm 5 μm)；柱温30 ℃；流速为1 mL/min；进样量10 μL；检测波长为359 nm；流动相：A相为乙腈，B相为0.3%磷酸水溶液，A∶B为(27∶73)等度洗脱。

2.2 供试样品的制备 精密称取0.1 g FNB与0.1 g FEA分别置于10 mL容量瓶中，加入流动相至刻度线于37 ℃下超声20 min充分溶解，补足失重后4 ℃保存。

2.3 对照品的制备 取芦丁、槲皮素与槲皮苷对照品均精密称定为3 mg，分别置于10 mL 量瓶中混合，用流动相定容至刻度。取上述标准品溶液各1 mL置于5 mL容量瓶中并用用流动相定容至刻度，此时芦丁、槲皮素与槲皮苷质量浓度为60 μg/ml。

2.4 专属性试验 在“2.1”所述的液相色谱条件下注入对照品与样品，记录芦丁、槲皮苷与槲皮素保留时间，计算分离度，理论塔板数。

2.5 线性关系与线性范围 取“2.3”项下混合对照品溶液配制成系列梯度的混合标准品对照液，按“2.1”项下所述色谱条件测定，记录芦丁、槲皮苷与槲皮素的峰面积。以混合对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归。

2.6 精密度试验 取“2.3”项下混合对照品溶液按“2.1”项下所述色谱条件重复进样测定6次，记录芦丁、槲皮苷与槲皮素的峰面积，计算RSD值。

2.7 重复性试验 分别取FEA与FNB6份，按“2.2”项下制备成供试样品，按“2.1”项下所述色谱条件测定芦丁、槲皮苷与槲皮素的峰面积，计算RSD值。

2.8 稳定性试验 取FEA与FNB按“2.2”项下制备成供试样品于室温中放置0、2、4、6、8、10、12 h，按“2.1”项下所述色谱条件测定芦丁、槲皮苷与槲皮素的峰面积，计算RSD值。

2.9 加样回收率试验 取同一批已知含量的FEA与FNB，并加入一定含量的对照品，按“2.2”项下制备成供试样品，按“2.1”项下所述色谱条件测定芦丁、槲皮苷与槲皮素的峰面积。计算芦丁、槲皮苷与槲皮素的含量，计算回收率，结果见表1～表4。由表中结果可知，用本方法检测辣蓼黄酮中芦丁、槲皮苷与槲皮素含量时对目标成分的损耗低，回收率在97%～99%之间。

2.10 样品测定 取不同批次的FEA与FNB每批次样品取3份，按“2.2”项下制备成供试样品，按“2.1”项下所述色谱条件测定芦丁、槲皮苷与槲皮素的峰面积。计算芦丁、槲皮苷与槲皮素的含量。

3 结果与分析

3.1 回归方程与线性关系 以各标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标建立回归方程，如图1所示。芦丁：Y=381177X-4828.4，R2=0.9999，槲皮苷:Y=823682X-665955，R2=0.9998，槲皮素:Y=659877X-442376，R2=0.9999。结果表明芦丁在进样量在10～100 μg/mL，槲皮苷在进样量在10～100 μg/mL，槲皮素在20～200 μg/mL内与峰面积呈良好线性关系。在“2.1”所述的液相色谱条件下，芦丁、槲皮苷与槲皮素保留时间分别为7.9、11.9和26.5 min，各峰分离度大于1.5，理论塔板数大于3000。供试样品相同的保留时间处无杂峰干扰，表明方法专属性良好。色谱图如图2～图6所示。

3.2 精密度试验 结果显示芦丁、槲皮苷与槲皮素的RSD值分别为0.12%、0.45%和0.25%，精密度符合兽药典要求。

3.3 重复性试验 按重复性实验要求，结果显示： 芦丁、槲皮苷与槲皮素的RSD值分别为1.10%、1.02%和1.03%，FNB的RSD值分别为0.68%、1.19%和0.61%。

3.4 稳定性试验 结果显示：FEA的RSD值分别为0.41%、0.17%和0.52%，得FNB的RSD值分别为0.41%、0.78 %和0.93%，表明供试品室温内放置12 h内稳定。

3.5 加样回收率试验 结果见表1～表3。由表中结果可知，用本方法检测辣蓼黄酮中芦丁、槲皮苷与槲皮素含量时对目标成分的损耗低，回收率在97%～99%之间。

3.6 样品测定 对不同批次，不同提取物的样品进行含量检测，结果如表4，结果显示为FEA中芦丁、槲皮苷与槲皮素的含量分别为281.97、160.98、83.31 mg/g，FNB中芦丁、槲皮苷与槲皮素的含量分别为150.33、147.51、73.82 mg/g。

4 讨论与小结

前人研究表明，辣蓼中所含黄酮成分有芦丁、槲皮苷、槲皮素、金丝桃苷、异鼠李素与山柰酚。芦丁能对糖尿病大鼠的氧化应激损伤，降低尿中蛋白含量[12]。芦丁与槲皮素在小鼠模型中显示出明显的抗惊厥作用[13]。有学者研究发现槲皮苷、芦丁、槲皮素与山柰酚为辣蓼中含量最多的黄酮[14]。所以本试验选取3者为指标物质对FEA、FNB相应成分进行含量检测。

在前期试验中曾经考察过用甲醇与0.3%磷酸水溶液进行洗脱，但槲皮素的色谱峰会出现拖尾，于是选用乙腈与0.3%磷酸水溶液作为流动相，测得芦丁、槲皮苷与槲皮素的峰形较好，各组分在各自浓度范围内线性关系良好。在精密度试验中，相对标准偏差(RSD)都小于1%，说明该方法精密度高，是可靠的。

运用高效液相色谱法测定FEA中芦丁、槲皮苷与槲皮素的含量分别为281.97、160.98、83.31 mg/g，FNB中芦丁、槲皮苷与槲皮素的含量分别为150.33、147.51、73.82 mg/g，本试验所测的芦丁、槲皮素与槲皮苷与Zhao F P[15]研究结果相一致。本研究运用的高效液相色谱检测辣蓼黄酮中芦丁、槲皮素与槲皮苷含量的方法，峰型对称性较好，回收率高，且操作简单、准确，精密度、重复性好，可以用于辣蓼黄酮中芦丁、槲皮素与槲皮苷的含量分析。

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DeterminationofContentsofRutin,QuercetinandQuercitrininFlavonoidsfromPolygonumhydropiper

GU Li-yuan1, TAO Jun-yu2, ZENG Yun1, WEI Ying-yi1, HU Ting-jun1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，GuangxiUniversity，Nanning，Guangxi530005,China; 2.SchoolofPreclinicalMedicine,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

HUTing-jun,E-mail:tingjunhu@126.com

The flavonoids ofPolygonumhydropiperwere separated and purified by means of macroporous adsorption resin, and its antioxidant activity was tested in previous research, which gained satisfied results. In order to obtain flavonoids ofPolygonumhydropipewith stable quality, and provide evidence for quality control in industrial production, high performance liquid chromatography for determination of total flavonoids inPolygonumhydropiperwas used with rutin, quercetin and quercitrin as reference substance. The results showed that the contents of rutin, quercetin and quercitrin from flavonoids ethyl acetate (FEA) inPolygonumhydropipewere 281.97, 160.98, 83.31 mg/g respectively; The contents of rutin, quercetin and quercitrin of flavonoids n-butanol (FNB) in polygonum hydropiper were 150.33, 147.51, 73.82 mg/g respectively. The method demonstrated advantage of simply,accuraty and sensitivity, and successfully applied to the analysis of rutin, quercetin and quercitrin content in flavonoids fromPolygonumhydropipe.

Polygonumhydropipe; flavonoids; high performance liquid chromatography

2017-06-26

A

1002-1280 (2017) 10-0039-07

S853.7

国家自然科学基金资助项目(31560708); 广西大学兽医学研究生培养基地建设项目(20160976)

谷俐媛，硕士研究生，从事兽医药理与毒理学方向研究。

胡庭俊。E-mail:tingjunhu@126.com.

(编辑：陈希)