犬新孢子虫巨噬细胞转移抑制因子(NcMIF)克隆表达 与其免疫调节作用鉴定

王长江，沈志强1,，金婷婷，武曰星，刘 慧，曲光刚

( 1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；2.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；3.华中农业大学，湖北武汉 43000)

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.10.03

犬新孢子虫巨噬细胞转移抑制因子(NcMIF)克隆表达 与其免疫调节作用鉴定

王长江2，沈志强1,2，金婷婷2，武曰星2，刘 慧3，曲光刚1*

( 1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；2.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；3.华中农业大学，湖北武汉 43000)

通过原核系统表达犬新孢子虫巨噬细胞转移抑制因子(NcMIF)，并对该蛋白的免疫调节作用进行分析。根据GenBank发表的序列，利用分子生物学软件设计了一对特异性引物，通过RT-PCR方法扩增出NcMIF全基因，经测序分析后，将NcMIF亚克隆到原核表达载体pET28a(+)，然后将鉴定为阳性的重组质粒转化到E. coli BL21(DE3)中用IPTG进行诱导表达。利用HPLC对可溶性表达的重组NcMIF蛋白进行纯化，去除内毒素，最后对NcMIF的免疫调节作用进行鉴定。结果显示，NcMIF没有明显的抗糖皮质激素的免疫抑制作用，也没有上调巨噬细胞TNF-α和NO表达量的作用，为进一步探究NcMIF的生物学功能及MIF在宿主免疫调节中的作用奠定了基础。

犬新孢子虫；巨噬细胞转移抑制因子；原核表达； 免疫调节

新孢子虫病(Neosporiasis)是一种原生动物性疾病，并在世界范围内广泛流行[1]。犬新孢子虫(Neosporacanium)不仅能够导致包括牛、羊、犬等孕畜流产、死胎和弱胎等严重繁殖障碍性疾病，还导致幼畜出现运动神经系统紊乱等症状，对养殖业造成极大的经济损失[2-3]。同时，在病人血清中也有检测出新孢子虫阳性的报道[4]，因此犬新孢子虫也可能是人兽共患寄生虫病。但是迄今为止，尚未有根除犬新孢子虫的药物和有效预防犬新孢子虫的疫苗。

犬新孢子虫感染过程中，天然免疫系统中的很多成分被激活，如巨噬细胞、树突状细胞等，这些被激活的细胞会释放如IL-2、TNF-α等一系列细胞因子。哺乳动物的巨噬细胞转移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)作为细胞因子的一种，与机体的败血性休克有关[5]，具有调节巨噬细胞和淋巴细胞应答[6]及内分泌的功能[7]。它不仅能够抑制单核巨噬细胞的随机迁移和糖皮质激素的抗炎症效果，而且能够抑制活化诱导的p53依赖性凋亡[8]。MIF还能够上调免疫细胞TLR4受体和促炎症细胞因子的表达，如TNF-α、IL-β、IL-6、IL-8和IL-12等，以及促进NO的分泌[9]。MIF能够在多种类型的细胞中表达，包括单核细胞、淋巴巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞[10]。MIF被证实能够与细胞表面的CD74受体结合[11]，同时也是趋化因子CXC受体非同源的配体[12]。

研究发现，MIF保守的CXXC序列是氧化还原酶作用的功能域；而N端第二位的脯氨酸则是互变异构酶活性的关键位点[13]。尽管MIF蛋白的催化活性与生物学功能之间的关系还不是很清楚，但是抑制MIF的互变异构酶作用能够降低LPS刺激巨噬细胞产生的TNF的量，提高败血症模型动物的成活率[14-15]。

近年来，许多的寄生虫MIF同系物被分离到，这其中包括Strongyloides MIF、Trichinella spiralis MIF及Brugia malayi MIF等，并且这些MIF同系物具有和它们哺乳动物宿主相似的生物学功能和免疫调节作用[16-18]。本研究克隆了NcMIF基因，利用大肠埃希菌进行表达并对该蛋白的免疫调节作用进行分析，为研究NcMIF在宿主免疫调节中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌种E.coliDH5α、BL21(DE3)及pMD-18T载体购自大连宝生物工程有限公司；pET28a(+)载体购自默克公司。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶NdeI和HindIII、T4 DNA连接酶及PCR反应试剂、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒及DNA Marker DL2000、卡那霉素(Kanamycin)均购自宝生物工程(大连)有限公司产品；M-MuLV反转录试剂盒购自NEB公司；BATEKE RNA提取试剂盒购自百泰克生物公司；Western blot发光底物购自Thermo公司；实验用绵羊由山东省滨州畜牧兽医研究院繁育饲养；其他常用试剂均为分析纯。

1.2 NcMIF基因的克隆与测序 基于NC1 NcMIF mRNA序列(NCLIV_042400，previously known as NC_LIV_113040，www.genedb.org)，利用分子生物学软件PRIMER 5.0设计出一对特异性引物，通过PCR方法扩增出NcMIF基因。上游引物序列为5'-ATACATATGCCAAAGTGCATGATCTAC-3'，其中在5'端加入NdeI酶切位点，下游引物序列为5'-TAAAGCTTTTAGCCAAAGGTGCGGTC-3'，其中在5'端加入HindIII酶切位点。采用BATEKE RNA提取试剂盒从犬新孢子虫中提取总RNA，取2 μg总RNA利用M-MuLV反转录试剂盒合成cDNA。以该cDNA为模板通过PCR方法扩增出NcMIF完整的阅读框，PCR反应条件如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经PCR纯化试剂盒纯化后，连接到pMD-18T载体，鉴定阳性克隆，送上海生工测序并对测序结果进行分析比较。

1.3 NcMIF蛋白的表达、内毒素的去除及纯化 将测序结果正确的基因片段亚克隆到pET28a(+)，构建重组质粒pET28a+NcMIF，并转入大肠埃希菌BL21(DE3)，以终浓度1 mmol/L IPTG 37 ℃进行诱导表达8 h。将诱导产物4 ℃条件下4000 ×g离心20 min，取上清，用裂解缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，PMSF 1 mmol/L，pH8.0)重悬细菌，-80 ℃/37 ℃反复冻融三次，然后用终浓度10 μg/mL的DNase/RNase 37 ℃消化30 min，然后4 ℃条件下20000 ×g离心20 min取上清，用于可溶性蛋白的纯化。

将蛋白用Triton X-114处理，以去除内毒素。首先将Triton X-114加到上一步分离到的上清液中至1%的终浓度，涡旋10 s，然后放置冰上5 min，涡旋之后37 ℃孵育10 min，最后20000 ×g，38 ℃离心2 min，收集上清，重复上述步骤7次，直到内毒素浓度低于50 EU/mg。重组蛋白rNcMIF经分子筛高压液相色谱法(SECHPLC)分离纯化，通过BCA方法测定纯化后的蛋白浓度，并通过SDS-PAGE对蛋白纯度和分子量进行分析。

1.4 免疫印迹分析 NcMIF样品经处理后在还原条件下用12% SDS-PAGE胶进行分离，然后将蛋白转到PVDV膜上，用3%的脱脂奶粉封闭PVDV膜后，在羊抗全新孢子虫抗体(1∶200)中室温下孵育1 h，然后用含有0.05% Tween20的PBS洗膜5次，每次5 min。将PVDV膜在1∶5000的羊抗兔IgG-HRP二抗中室温条件下孵育1 h，然后用含有0.05% Tween20的PBS洗膜5次，每次5 min。用化学发光底物(SuperSignal®West Dura Exrended Duration Substrate)进行显色并用成像仪拍照。

1.5 rNcMIF抗地塞米松免疫抑制功能鉴定 将500 μL大约含有1.5×105个RAW264.7巨噬细胞的DMEM细胞培养液平铺于48孔细胞培养板中，在37 ℃，5% CO2培养箱中培养20～24 h。为判定NcMIFs对糖皮质激素的反向调节作用，向含有或不含地塞米松(DEX)的培养基中分别加入递增浓度的rNcMIF，将细胞预培养1 h，然后加入脂多糖至终浓度10 ng/mL，继续培养16 h，收集细胞培养液上清，4 ℃ 20000 ×g离心20 min。上清中的TNF-α和NO分别利用ELISA试剂盒(eBioscience Inc，San Diego，CA)和格里斯反应方法进行检测与分析。格里斯反应分析如Straccia等[19]所述，即将150 μL样品加入96孔板中，另外加入20 μL 1 μmol/L的磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸(Sigma，St.Louis，MO)和30 μL含葡萄糖(Sigma，St.Louis，MO)、葡萄糖磷酸脱氢酶(Sigma，St.Louis，MO)和硝酸还原酶的混合液。在孔中混合半小时，然后分别加入20 μL 1%的磺胺和20 μL 0.1%N-(1-萘基)二盐酸乙二胺(Sigma，St.Louis，MO)。孵育5 min后，使用酶标仪(Molecular Devices SpectraMaxPlus384，Ramsey，MN)分别在550 nm和650 nm处读数。亚硝酸盐的浓度由亚硝酸钠标准曲线确定。

1.6 NcMIF对TNF-α和NO的免疫调节作用鉴定

为了评估NcMIF对TNF-α和NO的免疫调节作用，RAW264.7巨噬细胞用不同浓度的rNcMIF处理，然后加入脂多糖继续培养16 h，收集细胞上清，冻存于-80 ℃备用，同时设脂多糖空白组阴性对照，上清中的TNF-α和NO含量检测方法同1.5。

2 结 果

2.1 NcMIF基因克隆 利用一对特异性的引物，通过PCR的方法扩增到一条约348 bp的产物，核酸电泳结果如图1所示。将测序正确的NcMIF亚克隆到pET28a表达载体，构建重组表达质粒pET28a-NcMIF，并用Nde I和Hind III双酶切鉴定，电泳结果如图1第2、3和4泳道所示。

2.2 重组NcMIF的表达与纯化 NcMIF重组大肠埃希菌BL21(DE3)在37 ℃用1 mmol/L IPTG进行诱导表达，经过SDS-PAGE电泳验证，蛋白在分子量11 kDa处均有条带，且部分为可溶性表达。重组蛋白用SECHPLC进行纯化，纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定(图2)。去除内毒素后rNcMIF内毒素含量低于0.5 EU/mL。

2.3 NcMIF的免疫印迹分析 NcMIF免疫印迹结果表明在11 kDa左右出现明显的条带(图3)，说明rNcMIF能够与犬新孢子虫的阳性血清反应。

2.4 rNcMIF抗地塞米松免疫抑制功能鉴定 在RAW264.7巨噬细胞中验证rNcMIF抗地塞米松免疫抑制实验结果表明，不同浓度的rNcMIF均没有表现出抗糖皮质激素免疫抑制作用来上调巨噬细胞TNF-α和NO产量的功能(图4A、B)。

2.5 NcMIF对TNF-α和NO的免疫调节作用 RAW264.7巨噬细胞用不同浓度的rNcMIF处理，然后加入LPS继续培养16 h，收集细胞上清，检测TNF-α和NO的含量变化，结果证明rNcMIF同样也没有上调巨噬细胞TNF-α和NO的表达(数据未提供)。

3 讨 论

研究表明，马拉布鲁线虫来源的MIF(BmMIF-1)与人类MIF一样，具有控制巨噬细胞趋化运动的功能；在体外，BmMIF-1能够增加巨噬细胞TNF-α与IL-8的表达；在体内，BmMIF-1又通过诱导激活的巨噬细胞产生，促使T细胞向Th2细胞分化，使宿主产生Th2免疫应答，最终抑制促炎症细胞因子的产生，这成为拉布鲁线虫逃避宿主免疫应答的重要手段[20-21]。这种免疫调节作用很可能与MIF的氧化还原酶和互变异构酶两种酶的功能有关。

本研究首次报道了犬新孢子虫MIF同系物。通过分析发现，NcMIF具有哺乳动物MIF高度保守的氨基酸残基，说明NcMIF可能具有与哺乳动物MIF相似的生物学活性。为进一步研究NcMIF的相关功能和生物学特性，本研究利用原核表达系统成功表达了可溶性的rNcMIF，并通过HPLC系统对蛋白进行了纯化。通过对rNcMIF抗地塞米松免疫抑制功能和对TNF-α和NO的免疫调节作用进行研究，发现rNcMIF没有上述的免疫调节功能，由于NcMIF的免疫调节功能与MIF的氧化还原酶和互变异构酶活性密切相关，所以下一步将对NcMIF的酶进行鉴定。

关于NcMIF的其他生物学活性，以及NcMIF对在寄生虫感染宿主、逃避宿主免疫系统中发挥的作用有待进一步研究，为有效防控犬新孢子虫提供更多参考。

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Cloning,ExpressionandImmunoregulatoryActivitiesIdentificationofMacrophageMigrationInhibitoryFactorDerivedfromNeosporacanium

WANG Chang-jiang2，SHEN Zhi-qiang1,2, JIN Ting-ting2，WU Yue-xing2，LIU Hui3，QU Guang-gang1*

(1.ShandongBinzhouAnimalScience&VeterinaryMedicineAcademy,Binzhou，Shandong256600,China; 2.ShandongLvDuBio-ScienceandTechnologyCo.,LTD,Binzhou,Shandong256600,China; 3.HuazhongAgricultureUniversity,Wuhan430000,China)

WANGChang-jiang,E-mail：guanggangqu@163.com

To express macrophage migration inhibitory factor (NcMIF) ofNeosporacaniumby prokaryotic expression system and identify the enzyme activities of NcMIF, the NcMIF complete open reading frame (ORF) sequence was obtained based on sequences reported in the GenBank. And one pair of specific primers was designed to amplify the NcMIF gene from cDNA by using polymerase chain reaction (PCR) and the NcMIF ORF was sequenced and subcloned into pET28a(+). The recombinant plasmid was transformed intoE.coliBL21 and induced by IPTG. The recombinant protein was expressed in soluble way and purified by HPLC and endotoxin was removed from the recombinant protein and native proteins. Results showed that NcMIF had no effect to counter-regulate glucocorticoid activity in macrophages or to regulate TNF-α and nitric oxide production by macrophages. It will establish the foundation to explore the biological function of NcMIF and its role in host immune regulation of MIF.

Neosporacanium; macrophage migration inhibitory factor; prokaryotic expression; immunoregulatory

2017-06-26

A

1002-1280 (2017) 10-0018-06

S852.7

山东省自然科学基金资助项目(ZR2013CQ004)

王长江，硕士，从事病原源性免疫调节因子免疫调节功能的研究。

曲光刚。E-mail：guanggangqu@163.com

(编辑：陈希)