温清饮软膏对小鼠特应性皮炎皮损表皮中间丝聚合蛋白表达的影响

于春水 杨和荣 周建琼 胥兴文

(遂宁市中心医院皮肤科,四川 遂宁 629000)

温清饮软膏对小鼠特应性皮炎皮损表皮中间丝聚合蛋白表达的影响

于春水 杨和荣 周建琼 胥兴文

(遂宁市中心医院皮肤科,四川 遂宁 629000)

目的 探讨温清饮对小鼠特应性皮炎模型皮损表皮中间丝聚合蛋白(FLG)蛋白表达的影响。方法 构建小鼠特应性皮炎模型，检测温清饮作用前后皮损表皮中FLG蛋白的变化。结果 温清饮作用后小鼠特应性皮炎模型皮损表皮中FLG蛋白的表达增高，表达水平明显高于对照组。结论 温清饮上调小鼠特应性皮炎模型皮损表皮中FLG蛋白的表达。

温清饮；丝聚蛋白

特应性皮炎(AD)是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病，该病病因和发病机制不明，研究表明，AD的发病机制涉及皮肤屏障功能、天然免疫系统和获得性免疫系统的相互作用、相互影响和相互制约〔1〕。中医药在治疗AD、湿疹等皮肤功能障碍性皮肤病方面疗效独特。我们前期的研究发现，川芎嗪可抑制HaCaT细胞中成纤维细胞生长因子(FGF)10 mRNA的表达〔2〕。当归多糖(当归的主要成分)对HaCaT细胞的增殖具有显著抑制作用〔3,4〕。而当归、川芎是温清饮的组成成分之一，本文探讨温清饮对小鼠AD模型皮损表皮中间丝聚合蛋白(FLG)表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物与材料 7周龄健康小鼠32只(质量约20 g，雌雄随机)由川北医学院动物实验中心提供，随意饮水、饮食。中药材温清饮(白芍、当归、熟地黄、川芎、黄连、黄柏、黄芩、栀子)、单纯基质以及温清饮软膏由川北医学院附属医院药剂科提供及制备。FLG 抗体(Goat anti mouse FLG antibody，美国Abcam公司)。

1.2 动物造模 小鼠分组及皮损诱导：将32只7周龄小鼠随机分为4组，每组8只：正常对照组、AD模型组、温清饮治疗组、卤米松治疗组。参考DNCB诱导小鼠AD模型形成相关文献并稍加改进〔5〕，模型组、温清饮治疗组、卤米松治疗组小鼠足垫及脱毛后背部外涂0.1%DNCB溶液100 μl，1次/w。6 w后取正常对照组和模型组背部皮肤，做HE染色，显示模型构建成功。

1.3 给药及皮损取材 将上述动物模型分组处理，温清饮治疗组给予温清饮软膏，2次/d，持续治疗2 w；卤米松治疗组给予卤米松乳膏，2次/d，持续治疗2 w；正常对照组和模型组仍外涂丙酮。治疗2 w后观察各小组小鼠皮损情况，取背部脱毛处皮肤做HE染色及免疫组化实验。免疫组化染色步骤按试剂盒说明。

1.4 免疫组织化学染色结果评分及判定 根据小鼠皮肤表皮角质层和颗粒层FLG阳性表达细胞数量进行评分从而对其结果进行半定量的评估〔6〕。显微镜下观察每张切片的整体染色情况：① 200倍视野下选择5个具有代表性的区域，每个区域共计数200个细胞，阳性细胞所占百分比计分为0～3分，若无阳性细胞记0分；阳性细胞<25%计1分；阳性细胞在25%～50%计2分，阳性细胞>50%计3分。②着色强度计分：不着色计0分；轻微着色(呈淡棕黄色)计1分；中等着色计2分；强着色(呈明显棕黄色)及3分。最后，将以上两部分评分分数相加，进行统计结果分析。FLG表达阳性细胞为细胞质或细胞核呈棕黄色或棕褐色。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

免疫组化检测小鼠表皮FLG表达:①正常对照组及模型组皮肤表皮中均有FLG阳性表达的棕褐色颗粒，主要定位于细胞质及细胞核内，以细胞质为主；正常对照组小鼠表皮FLG弥漫分布于其表皮的角质层及颗粒层，并向棘层延伸，染色强度明显减弱，而模型组小鼠皮损角质层及颗粒层FLG的表达明显低于正常对照组，且在棘细胞层上部也有少量表达。温清饮治疗组及卤米松治疗组小鼠皮损FLG表达量明显较模型组增高，甚至几乎接近正常水平。②模型组与正常对照组阳性表达评分之间差异显著(1.80±0.262、4.80±0.185，P<0.01)；温清饮治疗组(4.22±0.128)及卤米松治疗组(4.34±0.207)与模型组之间差异显著(P<0.01)，但温清饮治疗组及卤米松治疗组和正常对照组无统计学差异(P>0.05)。

3 讨 论

AD以剧烈瘙痒和皮肤炎症为主要特征。AD病因十分复杂，包括遗传、皮肤屏障功能缺陷和免疫调节异常等〔7〕。皮肤屏障功能异常在AD的发病机制中发挥着重要的作用。研究发现大多数AD患者都有FLG基因的表达降低，考虑FLG缺陷是AD发病的危险因素〔8〕。

近年来，学者们对表皮功能屏障形成中不可或缺的表皮终末分化蛋白FLG有了更深一步的认识。AD和银屑病是两种常见的炎症性皮肤病，均表现为皮肤屏障功能受损〔9〕和皮损处与外周血中IL-17表达增加〔10〕。AD表皮屏障功能受损，亲水性和亲脂性物质的渗透增多，经皮水分丢失(TEWL)过多，使得皮肤变得干燥，缺少水分，因此维持正常的皮肤屏障功能是相当关键的。

小鼠FLG基因位于3号染色体，其结构与人类高度相似，且属于EDC成员，Howell等〔11〕通过免疫组化检测正常人及AD患者皮损处FLG表达时发现，AD患者皮损处角质层和颗粒层FLG的表达明显低于正常人，而AD患者皮损区FLG的表达比非皮损区更低。本实验结果表明正常小鼠皮肤表皮FLG蛋白的表达明显高于模型组，这与Howell等〔11〕研究结果一致。FLG在维持皮肤屏障功能中发挥着重要的作用，表达降低甚至缺失与AD的发生明显相关。经温清饮治疗后小鼠皮肤表皮FLG蛋白的表达明显上调，说明温清饮对FLG的表达发挥着积极的作用，温清饮对AD模型小鼠的皮损有明显的抑制作用，能上调表皮FLG蛋白的表达，从而使得皮肤屏障功能得以更快的修复。

1 Mc Grath JA.Profilaggrin,dry skin and atopic dermatitis risk:size matters〔J〕.J Invest Dermatol,2012;132(1):98-104.

2 于春水,谭升顺,眭维耻,等.川芎嗪对HaCaT细胞中成纤维细胞生长因子10影响的实验研究〔J〕.中国皮肤性病学杂志,2007;21(3):141-3.

3 于春水,牟韵竹,熊 芬,等.当归多糖对HaCaT细胞中成纤维细胞生长因子10影响的实验研究〔J〕.中国中西医结合皮肤性病学杂志,2010;9(2):87-9.

4 于春水,牟韵竹,苏江维,等.当归多糖诱导HaCaT细胞凋亡的实验研究〔J〕.中国中西医结合皮肤性病学杂志,2010;9(3):143-5.

5 Borowski LC,Lopes RP,Gonzalez TP,etal.Is steroid resistance related to multidrug resistance-Ⅰ(MDR-Ⅰ)in rheumatoid arthritis〔J〕.Int Immunopharmacol,2007；7(6):836-44.

6 Oh SH,Bae BG,Park CO,etal.Association of stress with symptoms of atopic dermatitis〔J〕.Acta Derm Venereol,2010;90(6):582-8.

7 Kasraise S,Werfel T.Role of macrophages in the pathogenesis of atopic dermatitis〔J〕.Mediat Inflamm,2013;2013(3):942-5.

8 Sandilands A,Terron-Kwiatkowski A,Hull PR,etal.Comprehensive analysis of the gene encoding filaggrin uncovers prevalent and rare mutations in ichthyosis vulgaris and atopic eczema〔J〕.Nat Genet,2007;39(5):650-4.

9 Hvid M,Vestergaard C,Kemp K,etal.IL-25 in atopic dermatitis:a possible link between inflammation and skin barrier dysfunction〔J〕.J Invest Dermatol,2011;131(1):150-7.

10 Gutowska -Owisiak D,Schaupp AL,Salimi M,etal.IL-17 downregulates filaggrin and affects keratinocyte expression of genes associated with cellular adhesion〔J〕.Exp Dermatol,2012;21(2):104-10.

11 Howell MD,Kim BE,Gao P,etal.Cytokine modulation of AD filaggrin skin expression〔J〕.J Allergy Clin Immunol,2007;120(1):150-5.

〔2015-08-28修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

四川省科技厅资助课题(2016JY0214)；四川省卫计委资助课题(150243)；辽宁市中心医院资助课题(2015S23)

于春水(1969-)，男，医学博士，主任医师，硕士生导师，主要从事皮肤屏障功能障碍。

R733.7

A

1005-9202(2017)02-0282-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.010