褪黑素对阿尔茨海默病大鼠学习记忆障碍的影响及作用机制

邓海峰 孙缦利 杨 伟 王兴红 常全忠

(漯河医学高等专科学校基础医学部,河南 漯河 462000)

褪黑素对阿尔茨海默病大鼠学习记忆障碍的影响及作用机制

邓海峰1孙缦利 杨 伟2王兴红 常全忠

(漯河医学高等专科学校基础医学部,河南 漯河 462000)

目的 探讨褪黑素(MT)对阿尔茨海默病(AD)大鼠学习记忆障碍的影响及作用机制。方法 SD大鼠随机分为3组：正常对照组、东莨菪碱模型组和MT组。正常对照组和模型组每天腹腔注射生理盐水2 ml；MT组每天腹腔注射MT溶剂(2 mg/kg) 2 ml，连续给药7 d，于第8天进行Morris水迷宫测试，测试6 d，每天测试前30 min各组(正常对照组腹腔注射等剂量的生理盐水)腹腔注射东莨菪碱1 mg/kg。于第15天开始进行电生理记录。结果 ①水迷宫测试6 d后，模型组逃避潜伏期的时间(61.86±8.84)s，与正常对照组(11.13±6.08)s相比，缩短趋势明显较慢(P<0.01)；MT组逃避潜伏期为(16.250±10.926)s，与正常对照组相比无显著差异(P>0.05)。水迷宫测试的第6天，模型组大鼠的穿环次数为(1.91±0.87)次，较正常对照组(3.34±0.69)次明显减少(P<0.01)；MT组大鼠的穿环次数为(3.15±0.72)次，与正常对照组相比无显著差异(P>0.05)。②给予100 Hz 1 s刺激后，正常对照组诱发反应的幅度为基准值的(156.36±9.69)%，MT组为(142.25±11.03)%，两组与刺激前相比均有显著差异(P<0.01)，模型组的幅度为基准值的(108.56±12.41)%，与刺激前相比无显著差异(P>0.05)；给予100Hz 1 s刺激后，正常对照组诱发反应的斜率为基准值的(137.31±13.74)%，MT组为(130.59±13.65)%，两组与刺激前相比均有显著差异(P<0.01)，模型组的斜率为基准值的(101.36±11.72)%，与刺激前相比无显著性差异(P>0.05)。结论 MT对东莨菪碱所致的大鼠学习记忆障碍有明显的改善作用，并且可以阻断东莨菪碱对皮层长时程增强的抑制。

褪黑素；东莨菪碱；学习记忆；皮层；长时程增强

目前阿尔茨海默病(AD)的发病机制还不是很清楚。近年研究发现在老年人和AD病人体内褪黑素(MT)的含量明显减少〔1〕。外源性注射一定剂量的MT对AD动物模型的学习记忆障碍有一定的改善作用〔2〕，但作用机制还不明确。为进一步明确MT对AD的治疗机制，本实验拟在在体水平采用行为学和电生理学等方法探讨MT对东莨菪碱致大鼠学习记忆障碍的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 健康雄性成年SD大鼠，体重(250±10)g，由南华大学实验动物中心提供，所有动物都在自然光暗周期的环境中饲养，自由觅食、饮水。动物随机分为3组(n=8)：正常对照组、东莨菪碱模型组和MT组。正常对照组和模型组每天腹腔注射生理盐水2 ml；MT组每天腹腔注射MT溶剂(2 mg/kg) 2 ml，连续给药7 d，于第8天开始造模并进行Morris水迷宫测试，测试6 d。

1.2 造模方法 参照Oh 等〔3〕方法于每天测试前30 min各组(正常对照组腹腔注射等剂量的生理盐水)腹腔注射东莨菪碱1 mg/kg，直到实验全部结束。

1.3 试剂和仪器 MT、东莨菪碱、乌拉坦均购自Sigma公司，Morris 水迷宫装置(中国医学科学院药物研究所研制)。

1.4 Morris 水迷宫测试 Morris 水迷宫水池中加入适量的墨汁，使水池成为不透明色(去除视觉干扰)。在圆桶的上缘等距离地设东、南、西和北4个标记点，作为大鼠进水池的入水点，以这4个入水点在水面和水桶底部的投影点，将水面和水桶部分均等的分为4个象限。将平台放置于第三象限的中间。水温保持在22℃～23℃。大鼠训练：训练时，将大鼠面向池壁从四个入水点分别放入水池，记录大鼠从入水到找到水下隐蔽平台并站立于其上所需时间，作为潜伏期，大鼠找到平台后，让其在平台上站立60 s。若入水后120 s大鼠未能找到平台，则将其轻轻从水中拖上平台，并停留10 s，然后进行下一次训练。每只大鼠从四个入水点分别放入水池为一次训练，两次训练间隔30 s，用纸巾将大鼠擦干净。

1.4.1 定位航行试验 观察和记录大鼠寻找并爬上平台的路线图及所需时间，即记录其潜伏期，历时5 d，每天上下午各训练4次(各个象限)，记录其潜伏期，上台后休息60 s，继续下一个象限训练。用于测量大鼠对水迷宫学习和记忆的获取能力。

1.4.2 空间搜索试验 第6天，在定位航行试验后去除平台，从同一个入水点放入水中，测其120 s内穿环次数。用于测量大鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的保持能力。

1.5 在体电生理记录 20%乌拉坦(0.8 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，将大鼠固定于脑立体定位仪上。记录电极位置(P：1.9 mm，LR：5.5 mm，H：0.8～0.9 mm)。触须刺激由电刺激器控制气泵产生气流，由玻璃微电极导出，气流方向由触须的正下方垂直于触须，一般引起的触须振动为-1 mm。当找到对应的主反应触须(PW)后，记录单刺激诱发的皮层反应及给予100 Hz 1 s的刺激后该诱发反应的可塑性变化。

1.6 统计学方法 应用SPSS12.0统计软件包进行单因素方差分析及LSD-t检验。

2 结 果

2.1 MT对大鼠定位航行试验的影响 随着测试的进行，各组大鼠的逃避潜伏期时间均有缩短趋势：正常对照组从第1天的(97.75±18.06)s 缩短到第6天的(11.13±6.08)s；模型组从第1天的(118.99±13.18)s 缩短到第6天的(61.86±8.84)s；MT组从第1天的(100.13±12.55)s 缩短到第6天 的(16.25±10.93)s。与正常对照组相比，模型组逃避潜伏期的时间缩短趋势明显较慢(P<0.01)；而MT组的缩短趋势虽略慢于正常对照组，但无显著差异(P>0.05)。这表明东莨菪碱的确可以导致大鼠学习记忆障碍，而MT对东莨菪碱诱导的学习记忆障碍有明显的改善作用。

2.2 MT对大鼠空间搜索试验的影响 正常对照组大鼠的穿环次数为(3.34±0.69)次；模型组大鼠的穿环次数为(1.91±0.87)次；MT组大鼠的穿环次数为(3.15±0.72)次。模型组的穿环次数较正常对照组明显减少(P<0.01)；MT组与正常对照组相比无显著差异(P>0.05)。表明MT对东莨菪碱诱导的学习记忆障碍有明显的改善作用。

2.3 MT对大鼠皮层可塑性的影响 正常对照组诱发反应的幅度为基准值的(156.36±9.69)%，MT组为(142.25±11.03)%，两组与刺激前(100%)相比均有显著差异(P<0.01)，模型组的幅度为基准值的(108.56±12.41)%，与刺激前相比无显著差异(P>0.05)；给予100 Hz 1 s刺激后，正常对照组诱发反应的斜率为基准值的(137.31±13.74)%，MT组为(130.59±13.65)%，两组与刺激前(100%)相比均有显著差异(P<0.01)，模型组的斜率为基准值的(101.36±11.72)%，与刺激前相比无显著性差异(100%，P>0.05)。提示正常对照组和MT组可以诱发突触反应的长时程增强(LTP)，而模型组没有诱发出LTP。这表明MT可以明显改善东莨菪碱对大鼠皮层LTP的抑制。

3 讨 论

东莨菪碱是M型胆碱能受体的拮抗剂〔4〕，易通过血脑屏障。腹腔注射东莨菪碱可以阻断中枢乙酰胆碱与其受体的结合，使突触间隙中过多的乙酰胆碱游离，一定范围内的乙酰胆碱是神经信号传递的基础，而过多的乙酰胆碱会产生神经毒性，致使胆碱能神经通路异常〔4〕。中枢胆碱能系统在学习、记忆、注意力等认知功能的调节中起关键作用，研究表明海马、皮层以及大脑其他脑区的胆碱能神经通路紊乱会引起学习记忆环路的调节异常〔5〕，导致AD或其他学习记忆障碍疾病的发生。目前，东莨菪碱致学习记忆障碍的动物模型在AD研究中被广泛运用，本实验研究结果与之前的报道一致。

MT是松果体分泌的一种吲哚胺类激素，具有高度脂溶性，外周给药能通过血脑屏障而发挥作用〔6〕。之前对MT的研究主要集中在调节昼夜节律〔7〕、睡眠〔8〕、抗氧化〔9〕、抗癌〔10〕等多项生理功能方面。近年研究发现MT对学习记忆也有一定的调节作用，但尚无定论，有研究认为MT对持续光照或药物引起的学习记忆障碍有改善作用〔11〕，也有报道MT能阻断大鼠海马齿状回及CA1区的突触LTP，据此认为MT对学习记忆有抑制作用〔12〕。这些研究结果主要是在离体水平得到的，在在体水平上的研究报道甚少。而在在体情况下，大脑内各结构之间的联系保持完整，生理环境更稳定，所得到的结果更能反映MT对学习记忆的调节功能。

本结果表明，MT可以明显改善东莨菪碱诱导的大鼠学习记忆障碍及大鼠内皮层LTP的抑制。其机制可能是：通过血脑屏障的东莨菪碱可以引起中枢乙酰胆碱酯酶(AchE)增多〔13〕，进而引起乙酰胆碱(ACh)水解增多，中枢ACh含量减少，而ACh可提高新生神经元的存活率及抗凋亡，从而对学习记忆施加影响，东莨菪碱导致的ACh减少会造成学习记忆的损伤；MT也可以通过血脑屏障影响胆碱能系统，不过与东莨菪碱的作用相反，MT可以通过增强胆碱乙酰化转移酶(ChAT)的活性抑制ACh过多的释放水解〔14〕，进而保护胆碱能神经元，改善东莨菪碱引起的中枢胆碱能系统异常，从而改善记忆环路的异常。

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12 Wang LM,Suthana NA,Chaudhury D,etal.Melatonin inhibits hippocampal long-term potentiation〔J〕.Eur J Neurosci,2005;22(9):2231-7.

13 Hayashi M,Tajima H,Hashimoto Y,etal.Secreted calmodulin-like skin protein ameliorates scopolamine-induced memory impairment〔J〕.Neuroreport,2014;25(9):725-9.

14 Wang JZ,Wang ZF.Role of melatonin in Alzheimer-like neurodegeneration〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2006;27(1):41-9.

〔2015-06-11回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

河南省科技厅基础与前沿技术研究(152300410014)；漯河医学等专科学校2015年度基础科学研究项目(2015-S-LMC06)

常全忠(1965-)，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事神经生理学研究。

邓海峰(1983-)，男，硕士，讲师，主要从事神经生理学研究。

R319

A

1005-9202(2017)02-0286-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.012

1 南华大学医学院基础医学部 2 阳谷县第一人民医院康复科