黄丹兰颗粒剂对肝癌Hca-F荷瘤小鼠的抗肿瘤作用及其机制

马文杰 ，庞淑婉，李继彬，邢正英，房志仲*

(1.天津市河东区上杭路街社区卫生服务中心，天津 300161； 2.天津医科大学药学院，天津市临床药物关键技术重点实验室，天津 300070)

黄丹兰颗粒剂对肝癌Hca-F荷瘤小鼠的抗肿瘤作用及其机制

马文杰1，庞淑婉2，李继彬2，邢正英2，房志仲2*

(1.天津市河东区上杭路街社区卫生服务中心，天津 300161； 2.天津医科大学药学院，天津市临床药物关键技术重点实验室，天津 300070)

目的：研究黄丹兰颗粒剂对小鼠Hca-F肝癌的生长抑制作用及机制。方法：建立小鼠Hca-F肝癌模型，口服灌胃不同浓度的黄丹兰颗粒剂连续10 d。称重检测黄丹兰颗粒剂对肿瘤生长、脾脏和胸腺指数的影响；采用ELISA法分析黄丹兰颗粒剂对荷瘤小鼠脾巨噬细胞的吞噬活性、细胞因子分泌等免疫指标的影响。结果：黄丹兰颗粒剂对小鼠实体瘤生长具有抑制作用，黄丹兰颗粒剂中剂量组与对照组相比有显著差异(P<0.05)；实验组小鼠脾指数和胸腺指数均高于对照组。黄丹兰颗粒剂中剂量组即可明显促进IL-2的产生，降低VEGF蛋白的表达。结论：黄丹兰颗粒剂对Hca-F肝癌小鼠肿瘤生长有抑制作用，可能与提高荷瘤小鼠细胞和分子免疫活性有关。

黄丹兰颗粒剂，Hca-F，抗肿瘤，免疫

黄丹兰颗粒剂是由苦参碱、黄芪多糖、丹参乙醇提取物、三七总苷、螺旋藻、绞股兰总皂苷和蝙蝠蛾孢菌丝体粉添加药用辅料等组成。该方剂是以中药汤剂的形式在临床中应用，具有调节免疫功能、逆转纤维化进程、溶解纤维斑块的功效，主治各器官系统纤维化，如慢阻肺、肝硬化、动脉粥样硬化、心肌肥大等临床症状。本研究对处方中药材的有效成分分别进行提取及精制，并将其制成颗粒剂，并初步探讨了黄丹兰颗粒剂对小鼠Hca-F肝癌的生长抑制作用及机制，为申报新药奠定理论基础。

1 材料

1.1 动物与试剂 昆明种小鼠，雌雄各半，6～8周龄，体重(20±2) g，中国军事医学科学院动物实验中心提供，SPF级实验室喂养；小鼠肝癌Hca-F细胞系(由大连医科大学病理学教研室提供)；环磷酰胺粉剂(0.2 g/瓶，山西普德医药股份有限公司)；免疫组化试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)；黄丹兰颗粒剂(自制)；生理盐水。

2 方法与结果

2.1 对Hac-F肝癌小鼠体内抑瘤的作用 从液氮罐中取出小鼠肝癌Hac-F小鼠细胞株解冻，加无菌生理盐水调整为瘤细胞浓度1×107/ml，在无菌操作下对小鼠进行右腋皮下注射0.2 ml。24 h后随机分为5 组，每组10 只。黄丹兰颗粒剂低、中、高3 个剂量组(分别给予200、400和800 mg/kg的混悬液)，口服灌胃给药1次/d(0.8 ml)，连续10 d，模型组给予等容积生理盐水，阳性对照组注射环磷酰胺20 mg/kg。给药后，每日观察小鼠食欲、排便、尿液、活动等情况。停药后次日断颈处死小鼠，剥瘤称重，称胸腺和脾脏(待用)重量；计算抑瘤率、脾脏指数和胸腺指数[1，2]。黄丹兰颗粒剂能够抑制肝癌Hca-F荷瘤小鼠肿瘤的生长，低、中、高 3个剂量组的抑瘤率分别为22.44%、40.24%和59.78%；其中，与模型组比较，黄丹兰颗粒剂高、中剂量组抑瘤率分别呈高度显著性差异(P<0.01)和一般显著性差异(P<0.05)，低剂量组与模型组的差异不具有统计学意义(P>0.05)，结果见表1。

表1 黄丹兰颗粒剂对肝癌 Hca-F 荷瘤小鼠抑瘤率的影响

与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.2 荷瘤小鼠脾巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响 取荷瘤小鼠随机分成6组，每组10只，分别为正常组、模型组、阳性对照组和黄丹兰低、中、高剂量组，各组给药方法同“2.1”项。于第10次给药后1～2 h内，每只鼠腹腔注射5%鸡红细胞0.4 ml，8 h后将动物脱颈椎处死，仰位固定于鼠板，腹部消毒处理，剪开皮肤经腹部注入生理盐水2 ml。转动鼠板1 min，然后抽取腹腔洗液1 ml，滴涂于载玻片上，每片0.2 ml，共2片，放在垫有湿纱布的搪瓷盘中，置37 ℃孵箱中温育30 min，取出玻片，置生理盐水中轻轻漂洗，除去未贴片的细胞。晾干，以丙酮-甲醇(1∶1)固定5 min，再用瑞氏-吉姆萨染液，染色3～5 min，用蒸馏水轻轻冲洗，晾干，油镜下观察。镜下可见巨噬细胞核呈蓝色，被吞噬的鸡红细胞呈椭圆形，核呈蓝色，而胞质被染成红色。镜下随机计数100 个巨噬细胞，记录吞噬有鸡红细胞的巨噬细胞数和被吞噬的鸡红细胞总数。按下列公式计算吞噬率和吞噬指数：吞噬率=100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的细胞数/100×100%。试验结果显示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠脾脏指数没有显著的改变，胸腺指数显著降低；黄丹兰颗粒剂高剂量组小鼠脾脏指数和胸腺指数与正常组小鼠和模型组小鼠比较具有显著性差异(P<0.01)，表明黄丹兰颗粒剂在一定程度上能够提高荷瘤小鼠的免疫功能，结果见表 2。

表2 黄丹兰颗粒剂对荷瘤 小鼠免疫器官指数的影响±s，n=10)

与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.3 对小鼠细胞分泌细胞因子(IL-2)的水平测定 取各试验组小鼠，眼眶球取血0.5 ml，先抽取20 μl 血液，用3%的冰醋酸稀释20倍，轻轻摇匀后使用细胞计数器进行白细胞计数。白细胞计数：在显微镜下用低倍镜(100×)计数4 个大方格的白细胞总数，然后将该数乘以 50，即得每 mm3的白细胞数。将剩余血液离心(3 000 r/min)10 min，取血清待测IL-2 含量，IL-2 测定采用ELISA 酶联免疫检测法测定细胞因子的含量[3，4]。黄丹兰颗粒剂组小鼠巨噬细胞的吞噬功能与模型组相比明显提高(P<0.01)，表明黄丹兰颗粒剂能够通过促进肌体巨噬细胞的吞噬能力，提高肌体的免疫力，结果见表3。

2.4 免疫组化检测 黄丹兰颗粒剂低、中、高剂量各组及环磷酰胺治疗组和模型组瘤体剥离后，切取标本组织约2 mm×2 mm×2 mm，固定，常规脱水、石蜡包埋、切片，5 μm 连续切片5 张，行VEGF免疫组织化学染色[5，6]。ELISA法检测结果显示，黄丹兰颗粒剂中、高剂量组均能显著升高血清中IL-2水平。VEGF表达的结果显示，黄丹兰颗粒剂各剂量组与模型组比较均能明显抑制VEGF蛋白的表达，结果见表4。

表3 黄丹兰颗粒剂对小鼠 脾巨噬细胞吞噬能力的影响±s，n=10)

与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

表4 各组小鼠血清中 IL-2 和VEGF表达水平比较

与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

小鼠腹水型肝癌(Hca)细胞系是上海药物研究所从小鼠实体型肝癌模型转变而来，多年来用于抗肿瘤药物的研究[7]。有研究表明，肿瘤可通过不同途径影响肌体的免疫功能, 使荷瘤宿主呈现不同程度的免疫抑制状态。肿瘤的发生和发展与整个肌体的免疫功能衰退或失调密切相关[8]。为研究黄丹兰颗粒剂对小鼠Hca-F肝癌的生长抑制作用及机制，建立小鼠Hca-F肝癌模型，口服灌胃不同浓度的黄丹兰颗粒剂，通过称重法检测黄丹兰颗粒剂对肿瘤生长、脾脏和胸腺指数的影响；通过镜检计数检测黄丹兰颗粒剂对荷瘤小鼠脾巨噬细胞的吞噬活性；采用ELISA法和免疫组化法分析黄丹兰颗粒剂对细胞因子分泌等免疫指标的影响。实验结果提示中、高剂量组黄丹兰颗粒剂对小鼠实体瘤生长具有抑制作用，高剂量组更明显(P<0.01)，并且黄丹兰颗粒剂可以促进荷瘤小鼠免疫功能的提高。黄丹兰颗粒剂中剂量组即可明显促进IL-2的产生，3个给药组均可降低VEGF蛋白的表达。研究结果显示黄丹兰颗粒剂能够极大地减缓Hca-F肝癌小鼠肿瘤生长速度，这或许与其能促进细胞和分子免疫功能更好地发挥有关。

黄丹兰颗粒剂是由苦参、黄芪、丹参、三七总苷、螺旋藻、绞股兰总皂苷和蝙蝠蛾孢菌丝体粉等组成。苦参素抗肝纤维化的作用机制是多方面的，一方面为抑制核转录因子-κB、结缔组织生长因子蛋白表达，抑制肝星状细胞(HSC)的激活与增殖，促进肝脏细胞外基质(ECM)分解；另一方面为苦参素通过调节TIMP-1/MMP-1 来抑制ECM在肝脏的沉积，从而起到对肝纤维化的拮抗作用[9,10]。临床药理研究证实，黄芪含有锰铁钙硒等微量元素，还含有黄芪多糖、黄芪皂苷和γ-氨基丁酸等，具有调节肌体免疫功能、促进肌体代谢、抗菌等作用。黄芪主要通过抗氧化作用、抑制星状细胞活化作用、抑制炎症、调节免疫功能、抑制胶原合成及减少胶原蛋白沉积，起到预防和治疗器官纤维化的效果。丹参能消除固有的胶原纤维[11]，同时实验研究发现丹参具有良好的抗炎、抗氧化作用，通过调节Bcl-2 基因表达从而发挥抗肝纤维化作用[12]。研究发现[13]，丹参能明显降低肝硬化患者血清透明质酸、层粘蛋白、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶的含量，提示丹参能较好地改善肝硬化。同时丹参还具有抑制肝星状细胞增殖和促进其凋亡的作用[14]。三七总苷具有保肝利胆的作用[15]，抑制肝细胞的凋亡可能是抗肝纤维化的作用机制[16]。螺旋藻属稀有藻类生物，营养丰富，富含藻多糖、藻蓝蛋白等多种生物活性成分[17]，经研究证实具有抗氧化活性比较强的物质是超氧化物歧化酶(SOD)，可以通过抗氧化作用来消除肌体内的氧自由基损伤自身组织细胞，从而增强免疫功能，增加对肝肾功能的保护[18]。目前研究发现，螺旋藻富含有机硒，可降低小鼠纤维化肝组织的氧化应激水平、具有抗肝纤维化、促进肝细胞再生、抑制肝脏癌前病变的作用[19]。绞股蓝含有很多种活性成分，包括黄酮类、水溶性氨基酸、绞股蓝糖苷(多糖)、绞股蓝皂苷、多种维生素等。绞股蓝总皂苷是一种清除剂，能够清除自由基，能够发挥抗自由基损伤的特殊功能，能改善肝功能，对各项指标的改善有很大作用[20]。绞股蓝皂苷中，绞股蓝皂苷A的抗氧化能力最突出，能提高SOD、GSH-PX酶的活性从而使抗氧化功能大大提高，能够阻止过氧化反应，保护肌体免受损伤，能使肝纤维化形成的速度减缓[21]。蝙蝠蛾孢菌丝体俗称虫草菌丝体，目前有许多关于其展开的研究，主要针对的是其对肝纤维化的延缓作用，但作用机制目前仍未有一个统一定论。在纤维化过程中，有诸多细胞因子的参与，例如较重要的VEGF、TGF-β1因子。有实验研究发现虫草菌丝可以抑制TGF-β1 和VEGF 表达从而能有效减轻大鼠肝纤维化过程[22]。中医理论认为肝纤维化的病理机制有两个主要原因，分别是湿热瘀毒和正气不足，使肝纤维化发展的外因是湿热瘀毒，正气不足是肝纤维化发展的另外原因，在其发展中起着内在作用，而且很重要[23]。黄丹兰颗粒剂方中的黄芪、丹参、螺旋藻、绞股兰总皂苷和蝙蝠蛾孢菌丝体粉均有良好的抗氧化作用[12,21,24]，可以增强肌体免疫功能；苦参中主要活性成分为苦参碱和氧化苦参碱，近年来研究发现，其具有抗炎、抗菌、抗病毒、抑制免疫、抗纤维化、抗肿瘤等生物学作用[25]；三七总苷具有保肝利胆的作用[15]，研究发现其可以通过多种机制发挥抗肝纤维化的作用[26-29]。

1 蒋艳，姜孝新.枸杞多糖对肝癌Hca-F荷瘤小鼠的抗肿瘤作用及其机制[J].肿瘤药学，2011,1(4):391-394

2 张丽华，吕莉莉，张亚囡，等.柴胡总皂苷肝毒性肝纤维化损伤机制研究[J].中国药物警戒，2012，9(11)：652-655

3 刘宏，贾彦，杨婧，等.膈下逐瘀汤对免疫性肝纤维化大鼠肝组织MMP-9和TIMP-2表达的影响[J].中华中医药杂志，2012，27(2)：450-453

4 李珊，蔡锐，伍参荣.加味四逆散对血吸虫病小鼠肝纤维化相关因子表达的影响[J].中国中医药信息杂志，2011，18(2)：41-43

5 潘亮，杨大明.血清羟脯氨酸含量在实验性肝纤维化中的变化[J].南通医学院学报，2004，24(2)：136-137

6 叶立红，王羽中奎，杨莉，等.软肝化坚颗粒对肝纤维化模型C57小鼠肝组织α-SMA、TGFβ1表达和Ⅰ型胶原水平的影响[J].临床肝胆病杂志，2012，28(9)：685-688

7 陈瑞婷, 胥彬.斑蝥素的药理研究[J].中华医学杂志,1977,57(8):475-477

8 杨镇.肿瘤免疫学[M]. 武汉:湖北科学技术出版社,1998:54-56

9 杨华，张知贵，封家福，等.苦参素对肝纤维化大鼠肝组织NF-κB和CTGF表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(14):245-246

10 张知贵，杨华.苦参素对免疫性肝纤维化大鼠肝脏组织MMP-1，TIMP-1 表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(11):236-237

11 柳占彪，许放，张少卓，等.复方丹参滴丸对大鼠肝纤维化治疗作用的组织病理学影响[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(8):246-248

12 李方春，席微娜，席文娜，等．丹参对大鼠肝组织Bcl-2表达的影响及意义[J].南昌大学学报，2010，50(5):16-19

13 张桂芳.丹参注射液抗肝炎肝纤维化效果的量效研究[J].甘肃中医学院学报，2010，27(4):19-22

14 周锐，王建祥，刘峰，等.丹参素对TGFβ-1诱导的肝星状细胞增殖与活化的影响[J].细胞与分子免疫学杂志，2011，27(4):461-462

15 姜辉，高家荣，刘新平，等.三七总皂苷抗小鼠免疫性肝损伤的研究[J].中药药理与临床，2011，27(4):33-36

16 姜辉，高家荣，张家富，等.三七总皂苷对肝纤维化大鼠的保护作用及机制[J].中药药理与临床，2013，29(3):71-74

17 黄峰，郭云飞，陈昱，等.螺旋藻(Spirulina platensis)生物转化富硒形态对自由基的清除作用[J].暨南大学学报，2015，36(3):202-207

18 Vijaya P,Siddharth R T H S,Roopesh S R．Protective effect of spirulina against 4-nitroquinoline-1-oxide induced toxicity[J].Mol Biol Rep, 2011, 38(1)：309-317

19 李蜜，徐标.富硒螺旋藻对日本血吸虫肝硬化小鼠肝组织端粒酶活性的影响[J].现代预防医学，2014，41(18):3387-3390

20 冯琴，李雪梅，胡义杨，等.绞股蓝总皂苷对二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化的防治作用[J].中国中药杂志，2012，37(4):505-508

21 张猛猛，田冰洁，洪秀云，等.纯化的绞股蓝皂苷的抗氧化活性研究[J].生物技术，2013，23(1):76-78

22 赵延龙，杨柳明.虫草菌丝在大鼠肝硬化过程中对TGF-β1 和VEGF 表达影响研究[J].现代生物医学进展，2012，12(27):5248-5250

23 席奇，刘亚珠，宋春荣，等.柔木丹颗粒联合恩替卡韦治疗乙型肝炎肝纤维化45例疗效观察[J].中医药导报，2015，21(24):46-48

24 夏丽君.黄芪在体内抗氧化作用的实验研究[J].辽宁中医药大学学报，2010，12(5):232-233

25 李大寿.苦参碱治疗慢性乙型肝炎肝纤维化45例临床观察[J].中国民康医学，2011，23(21):2701-2703

26 曾文勇，石小枫，刘杞，等.三七总皂苷对肝纤维化大鼠胶原及TGF-β1 mRNA表达的影响[J].胃肠病学和肝病学杂志，2010，19(9):795-798

27 方翠艳，唐明会，赵静媛，等.三七脂肝丸对非酒精性脂肪肝患者肝纤维化指标的影响[J].中国伤残医学，2013，21(11):240-240

28 张永生，徐珊，赵育芳，等.三七总苷对肝纤维化模型大鼠的干预作用[J].中医杂志，2011,52(19):1671-1675

29 张永生，徐珊，赵育芳，等.三七总苷对二甲基亚硝胺致肝纤维化大鼠胶原代谢的影响[J].中华中医药杂志，2012，27(2):437-440

2016-09-14

R967

A

1006-5687(2016)06-0012-04

*通信作者：房志仲，E-mail:fangzhizhong@tmu.edu.cn。