血浆游离cf-DNA定量分析在脓毒症患者诊断中的临床价值

银雪 杨敬平 孙德俊 王文明

·论著·

血浆游离cf-DNA定量分析在脓毒症患者诊断中的临床价值

银雪1杨敬平2孙德俊1王文明1

目的探讨脓毒症患者血浆游离DNA(cf-DNA)定量检测的临床应用价值。方法选取2012年11月至2013年5月，收治于包钢医院呼吸与危重症医学科的35例脓毒症患者和31例全身炎症反应综合征(SIRS)患者，并以17例健康者血浆作为对照样本；用“血浆游离DNA提取试剂盒”提取血浆cf-DNA，采用荧光定量PCR技术(SYBR Green I染料法) 检测血浆DNA水平，酶联免疫吸附测定法检测血清降钙素原(PCT)和C-反应蛋白(CRP)水平，并应用ROC曲线分析比较cf-DNA、PCT及CRP在脓毒症诊断中的价值。结果脓毒症组cf-DNA明显高于SIRS组和健康对照组，差异有显著性(P<0.001)；入院第1天cf-DNA浓度显著高于第3天，差异有显著性(P<0.001)；入院第1天的cf-DNA浓度与SOFA评分具有相关性，SOFA评分越高，其cf-DNA越高，且差异有统计学意义(r=0.561，P<0.001)；以血浆cf-DNA浓度≥8 939 GE/ml作为诊断脓毒症的临界值，其检测的灵敏度为77.14%，特异度为80.65%。结论血浆游离DNA的定量检测可作为脓毒症的早期预测、随访观察疗效和监测复发的指标。

cf-DNA； 降钙素原； C-反应蛋白； ROC曲线； 脓毒症

脓毒症是感染灶或存在细菌引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，是细菌对宿主的一种全身性感染反应，患病率高[1]。血浆游离DNA(cell-free DNA，cf-DNA)是一种无细胞状态的、片段化的胞外DNA，存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中，与细胞凋亡具有相关性[2]。近几年已经报道了某些临床疾病的血液中含有高浓度的cf-DNA，如癌症、创伤、烧伤、急性心肌梗死、中风、休克等[3]。其中，脓毒症患者和危重症患者的血液中cf-DNA的含量明显上升[4-5]。本实验通过测定脓毒症患者血浆标记物cf-DNA，并与C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)、降钙素原(procalcitonin, PCT)相比较以此判断其诊断脓毒症的精准度。

资料与方法

一、一般资料

收集2012年11月1日至2013年5月30日在我院呼吸与危重症医学科住院患者，诊断标准采用2001年12月在华盛顿召开的“国际脓毒症会议”标准[6]，其中SIRS组31例，男性20例，女性11例，年龄为20～84岁，平均年龄62岁；脓毒症组35例，男性20例，女性15例，年龄为27～79岁，平均年龄69岁；健康对照组为本单位健康体检者，共17例，男10例，女7例，年龄为41～70岁，平均年龄63岁。病例组和对照组相比，年龄、性别无显著性差异。其中，脓毒症组原发病灶包括：肺部感染28例，急性扁桃体炎2例，泌尿系感染4例，胆系感染1例。排除标准：①获得性免疫缺陷综合征；②器官移植术后接受过免疫抑制剂治疗；③前4周内使用过糖皮质激素；④前8周内接受过化疗；⑤年龄<18岁；⑥中途自动出院而退出者。

二、主要试剂和仪器

血浆游离DNA提取试剂盒(北京久峰润达生物技术有限公司)、血液基因组柱式小量提取试剂盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、引物(GAPDH)由上海英潍捷基有限公司合成、全自动酶标仪、实时荧光定量PCR仪、低温高速离心机。

三、实验步骤

1. DNA的提取：所有入组患者均于入院时、入院第3天取外周静脉血2 ml置于EDTA管中，所有标本均2 h内处理。处理方法：室温静置30 min后，4 ℃ 1 600×g离心10 min取上层血浆(勿触碰白膜层)1 000 μl，再以4 ℃ 12 000×g离心10 min仔细吸取上清500 μl，置于无菌EP管中。同样方法收集健康志愿者外周静脉血。以“血浆游离DNA提取试剂盒”说明书(北京久峰润达生物技术有限公司，TX-50)进行抽提，提取cf-DNA。以EDTA管抽取正常健康人外周静脉血2 ml，以“血液基因组柱式小量提取试剂盒”(北京康为试剂生物技术有限公司，CW2087)进行抽提，提取全基因组DNA。每个标本最后洗脱液为50 μl。

2. 引物设计：根据NCBI gene bank上编号NM_002046.3(GAPDH)，按SYBR Green Ⅰ 定量PCR引物设计要求设计定量PCR扩增引物。TH-GAPDH-F：5-CCAGGTGGTCTCCTCTGACTTC-3′,TH-GAPDH-R: 5-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′，引物由上海英潍捷基有限公司设计并合成。

3. 实时荧光定量PCR： PCR反应体系总体积为20 μl，包括10 μl SYBR®Premix Ex Taq Ⅱ，0.8 μl上游引物，0.8 μl 下游引物，8.4 μl待测样品或标准品。每个样本和空白对照都设立重复管。反应条件：预变形95 ℃ 30 s，变形95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 20 s延伸72 ℃ 20 s(共40个循环)。

4. 血清PCT、CRP的检测：本院检验科检测，酶联免疫吸附测定法测定。

四、统计学方法

实验数据采用SPSS13.0 统计软件包进行分析，三组比较采用方差分析，非正态分布的计量资料以中位数和四分位数间距表示，两组均数比较采用t检验，多个样本比较采用秩和检验，双变量相关分析用Spearman相关检验，以P<0.05为差异有统计学意义，评价各指标诊断脓毒症的能力采用ROC曲线。

结 果

一、患者的基本资料

入选的发热患者66例，其中脓毒症组35例，SIRS组31例，脓毒症组中院内死亡率、APACHE Ⅱ评分、SOFA评分均高于SIRS组，差异有显著性(P<0.001)，SIRS组的肌酐清除率与脓毒症组比较差异有统计学意义(P=0.007)，二组之间年龄比较无统计学意义(P=0.08)，见表1。

表1 二组患者的基本资料(n)

注：P值为脓毒症和SIRS两者比较

二、入院后第1天二组cf-DNA的比较及其PCT、CRP的关系

17例正常人外周血浆游离DNA浓度为188(166-258)GE/ml，与SIRS组及脓毒症组之间血浆游离DNA比较，三组间差异有统计学意义(P<0.001)，经两两比较，脓毒症组的cf-DNA的浓度高于正常对照组(P<0.001)及SIRS组(P<0.001)，差异有显著性；SIRS组cf-DNA的浓度高于正常对照组(P=0.011)，差异有显著性。由表2得知，脓毒症组的cf-DNA、PCT及CRP浓度均显著高于SIRS组，差异均具有统计学意义(P<0.001)。

三、入院第1天与第3天cf-DNA的比较

根据血浆游离DNA测得的时间不同，第1天cf-DNA的中位数为9 088 GE/ml，四分位数间距为5 584～14 791 GE/ml，第3天cf-DNA的中位数为7 337 GE/ml，四分位数间距为4 460～12 437 GE/ml，二者存在显著性差异(P<0.001)，脓毒症患者经过治疗后cf-DNA较入院时明显降低，见图1。

图1 不同时间cf-DNA的浓度比较

四、cf-DNA、PCT、CRP在脓毒症患者中的预测价值及cf-DNA与SOFA评分的关系

入院第1天cf-DNA在预测死亡率的灵敏度为100%，特异度为75.86%。如图2示，cf-DNA的AUC为0.92，95%可信区间为0.776～0.984，可以认为cf-DNA在脓毒症患者中预测死亡率价值高，其cutoff值为21 150 GE/ml；而PCT、CRP的预测价值低，AUC分别为0.684和0.649，其中阳性似然比、阴性似然比，阳性预测值，阴性预测值，见表3。

图2 ROC曲线

入院后患者进行SOFA评分。与入院第1天血浆旅游DNA比较，二者具有相关性(r=0.561,P<0.001)，见图3。将SOFA评分结果分为四组，并命名为group1(0～6)、group2(7～9)、group3(10～11)、group4(12～19)，与入院第1天cf-DNA进行两两比较， group1 与group3之间差异有显著性(P=0.02)，group1 与group4之间差异有显著性(P=0.001)，group2 与group4之间差异有显著性(P=0.004)，可以得知，SOFA评分越高，其cf-DNA越高，见图4。

图3 cf-DNA与SOFA之间的线性相关性

表2 二组患者血浆游离DNA、PCT及CRP的比较

注：与SIRS比较，aP<0.01，Md：中位数；IQR：四分位数间距

表3 脓毒症患者cf-DNA、PCT及CRP对死亡率的评估

注：Cutoff：诊断点，AUC:受试者工作特征曲线下面积，Sens:灵敏度，Spec：特异度，PPV：阳性预测值，NPV：阴性预测值，+LR：阳性似然比，-LR: 阴性似然比

图4 cf-DNA与SOFA评分的关系

讨 论

脓毒症是病原菌感染的全身炎症反应综合征，若诊治不及时，可快速发展为脓毒症休克和多脏器功能障碍综合征，其病情危险，病死率高。近年来发现脓毒症患者可能与细胞凋亡有关，其中cf-DNA在各种慢性和急性疾病中广泛的受到关注和研究[7]。cf-DNA是一种片段化、小的双链分子、无细胞状态的的胞外DNA，具有较低的分子量[8]，广泛存在于脑脊液、血液及滑膜中，其在正常人的血液中含量甚微，而机体在特殊状态时，如感染、肿瘤、中风、心梗或妊娠等[9]，含量显著增加。另外，创伤和治疗过程中，也可能导致游离DNA释放到循环血液中[10]，其检测早已应用于临床[11-12]。高浓度cf- DNA与重症患者入住ICU具有良好的相关性[13-14]。这表明cf-DNA学标记物可作为预测脓毒症指标之一。目前许多实验都表明细胞凋亡定量的建立对脓毒症诊断至关重要[15]。本研究结果表明，cf-DNA浓度与疾病的严重程度成比例增加(脓毒症组的cf-DNA浓度显著高于SIRS组)，并且第1天的血浆游离DNA的结果可以作为预测死亡率的指标，这与早前的研究存在一致性[16]。

目前，PCT和CRP是诊断细菌和真菌感染最有价值的生物标志物[17]。PCT是一种无激素活性的降钙素前肽物质，在体外稳定性很好，血浆PCT在健康人血液中含量极低。有研究发现，机体被细菌、寄生虫和真菌感染时，PCT水平显著增加与感染的严重程度及预后呈相关性。其在全身性细菌感染和脓毒症辅助鉴别诊断、疗效观察、预后判断等方面的临床价值颇高[18]。CRP是一个重要的急性反应蛋白，参与不同病理过程的免疫反应，在各种急性炎症、心肌梗塞、放射性损伤、手术创伤等疾病发作后数小时可成倍增长，病变好转可降至正常，但其特异性差。研究发现cf-DNA对感染诊断价值比PCT、CRP诊断价值高[19]，而本研究结果也与文献报道相一致。

SOFA评分是一类描述MODS的发生、发展和评估发病率的评分系统，可预测预后，并对疾病的发病率、疾病过程、病情判断可有更加深入的认识，同时也可评价新的治疗方案对器官功能或衰竭过程的影响，还可评估预后、预测死亡率[20-29]。本实验利用SOFA评分可预测死亡率这一优点，结合cf-DNA，观察SOFA评分与cf-DNA之间的关系。研究显示，入院时SOFA评分越高，病情越重，死亡风险越高，其cf-DNA浓度越高，这与Saukkonen等[4]研究结果相一致。ROC曲线是灵敏性和特异性的相互关系评定指标。曲线下的面积越大，诊断价值越高，本实验结果显示，cf-DNA在脓毒症患者中预测死亡率价值最高，而PCT、CRP的预测价值最低。因此cf-DNA可作为预测脓毒症指标之一。

cf-DNA可以作为预测脓毒症的辅助指标，其不足之处是不能完全诊断脓毒症，PCT、CRP 及cf-DNA联合检测可能是今后这一领域的主要研究方向，但有些方面仍存在较大分歧，仍然需要大样本、多中心和前瞻性的随机研究。随着对脓毒症相关特异性的不断深入研究，cf-DNA检测将会具有广泛的临床应用前景。

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(本文编辑：王亚南)

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Quantitative analysis of cell-free plasma DNA in human sepsis

YinXue1,YangJingping2,SunDejun1,WangWenming1.

1DepartmentofRespiratoryMedicine,theWuhaiPeople′sHospital,Wuhai016000,China;2RespiratoryandCriticalCareMedicine,BaoganHospital,Baotou014010,China

YangJingping,Email：yangron@sina.com.cn

Objective To quantify the circulating DNA in plasma from patients with sepsis,evaluate its potential clinical significance. Methods Plasma DNA from 83 cases(35 cases with sepsis is the sepsis group, 31 cases with systemic inflammatory response syndrome is the SIRS group, and 17 cases is the healthy control group) extracted using a Plasma free DNA extraction kit and was quantified by a real-time PCR method(SYBR Green I dye assay), concentrations of procalcitonin (PCT) and C-reactive protein (CRP) were measured by enzyme-linked immunosorbent assay, receiver operating characteristic(ROC) curves were plotted to analysis diagnosis value in the sepsis which through quantity of cf-DNA , PCT and CRP. Results The cf- DNA in sepsis was significantly higher (P<0.001) than that of the patients with SIRS and the healthy controls; The concentration of cf-DNA in the first day was significantly higher (P<0.001) than the patients of the third day; the plasma free DNA concentration of the first day associated with SOFA score(r=0.561,P<0.001), the higher cf-DNA are, the higher SOFA score; The best cutoff value of plasma DNA at baseline was 8 939 GE/ml, with a sensitivity of 77.14%, specificity of 80.65%. Conclusion cf-DNA quantification may be a useful marker for early prediction of sepsis, and for monitoring the therapeutic efficacy and recurrence.

cf-DNA; Procalcitonin; C-reactive protein; Receiver operating characteristic; Sepsis

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2016.06.011

社会发展科技支撑项目(2013S2006-1-4)

016000 内蒙古 乌海，乌海市人民医院呼吸内科1014010 包头，包钢医院呼吸与危重症医学科

杨敬平，Email：yangron@sina.com.cn

R563

A

2015-11-23)